本文來(lái)源于：新藥新發(fā)現(xiàn)

蛋白水解靶向嵌合體 (PROTAC) 是一種新興的靶向降解蛋白質(zhì)的治療策略，它通過(guò)將目標(biāo)蛋白（POI）帶至 E3 連接酶附近，利用泛素蛋白酶體系統(tǒng) (UPS) 來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。相比傳統(tǒng)的抑制蛋白活性，PROTAC 能夠選擇性地從細(xì)胞中清除特定蛋白，提供了事件驅(qū)動(dòng)的降解機(jī)制，避免了單純的占用率依賴(lài)。藥理學(xué)上，PROTAC 有助于更徹底地阻斷蛋白功能，延長(zhǎng)作用時(shí)間，并可能模擬基因敲除的效果。由于三元復(fù)合物的形成依賴(lài)于 POI 和 E3 的特異性相互作用，PROTAC 能夠選擇性地作用于特定異構(gòu)體和組織。研究表明，PROTAC 已在臨床中顯示出良好的耐受性和療效，目前正在后期臨床試驗(yàn)中。阿斯利康概述了 PROTAC 各組成部分的優(yōu)化以及藥物化學(xué)家在這一充滿挑戰(zhàn)的領(lǐng)域?qū)で髮?shí)現(xiàn)口服生物利用度所面臨的困難。并基于性質(zhì)，總結(jié) PROTAC 優(yōu)化的方法。

01 Clinical PROTACs

截至2024年7月，共有13種結(jié)構(gòu)公開(kāi)的蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）進(jìn)入臨床試驗(yàn)，主要用于腫瘤治療，其中一種用于炎癥治療。兩種PROTAC（ARV-110和KT-413）因戰(zhàn)略原因停產(chǎn)。在這些化合物中，12種與E3連接酶cereblon（CRBN）結(jié)合，只有DT-2216使用von Hippel-Lindau (VHL) E3連接酶，且需靜脈注射。CRBN結(jié)合PROTAC的分子量在711-958 Da之間，親脂性（pH 7.4下的logD）在1.4-4.8范圍內(nèi)，色譜極性表面積（ePSA）范圍為107-146 Ų。圖2A顯示，口服PROTAC（藍(lán)色區(qū)域）大多超出Lipinski的“5法則”（Ro5）和Veber的指南（綠色區(qū)域），但氫鍵供體（HBD）除外。在親脂性方面，部分PROTAC超過(guò)小分子的logP（≤5）和logD（1-3）限制。ePSA的范圍較窄，顯示其在口服PROTAC設(shè)計(jì)中更具指導(dǎo)價(jià)值。盡管超出傳統(tǒng)物理化學(xué)限制，口服仍為首選給藥途徑，除DT-2216和KT-413外，這兩者專(zhuān)為血液系統(tǒng)癌癥開(kāi)發(fā)。

02 Structure of PROTACs

每種臨床蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）都經(jīng)過(guò)廣泛優(yōu)化，以在藥理和物理化學(xué)特性之間實(shí)現(xiàn)最佳平衡。PROTAC 的設(shè)計(jì)包括三個(gè)模塊化組分——目標(biāo)蛋白（POI）、E3連接酶配體和連接基，設(shè)計(jì)技巧在于平衡各個(gè)部件的特性，使得最終的 PROTAC 化合物特性整體可接受。

目標(biāo)蛋白（POI）： PROTAC 通常使用對(duì)目標(biāo)蛋白具高效結(jié)合力的抑制劑或拮抗劑，多為中性分子并且氫鍵供體（HBD）數(shù)量較少，這樣可以避免暴露的 HBD，以利于提高細(xì)胞膜透過(guò)性。大多數(shù)臨床PROTAC 的 POI 結(jié)合基序溶解性較好，并能連接到 E3 連接酶配體，某些 PROTAC（如 ARV-393）含有少數(shù)幾個(gè)正式供體，但分子內(nèi)氫鍵可能屏蔽了這些供體以減少親水性。

E3連接酶配體： 在臨床 PROTAC 中，cereblon（CRBN）是最常用的 E3連接酶，因其低分子量、高極性和高效性成為理想選擇。CRBN 配體通常來(lái)源于免疫調(diào)節(jié)藥物（IMiD）如沙利度胺（Thalidomide）和來(lái)那度胺（Lenalidomide），其主要化學(xué)結(jié)構(gòu)包括戊二酰亞胺或二氫尿嘧啶環(huán)，具有一個(gè)氫鍵供體且對(duì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無(wú)敏感性。為了應(yīng)對(duì) IMiD 類(lèi)配體的安全問(wèn)題（如致畸性和血液毒性），一些新的 CRBN 配體被應(yīng)用于 PROTAC，如包含差向異構(gòu)體混合物的 KT-474 和 CFT-1946 等，其中二氫尿嘧啶基團(tuán)在 CFT-1946 中展現(xiàn)出改良的化學(xué)和代謝穩(wěn)定性。

連接子： PROTAC 的連接基通常為單個(gè)叔胺堿基（例如哌啶、哌嗪或氮雜環(huán)丁烷），這些堿性基團(tuán)通常經(jīng)過(guò)適度調(diào)節(jié)，以確保 pKa 在合理范圍內(nèi)。對(duì)于口服 PROTAC，堿性通常低于預(yù)測(cè) pKa 9.1。連接基中多含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)以增加剛性和構(gòu)象穩(wěn)定性，大部分臨床口服 PROTAC 中至少包含兩個(gè)環(huán)，而在靈活性方面則使用少量亞甲基或乙氧基作為間隔基。例如，CFT-1946 的連接基較為剛性，因其酰胺將哌啶與螺環(huán)連接起來(lái)，而 KT-474 的連接基較靈活，使用了炔丙基醚間隔基。高剛性的連接基有助于提升靶標(biāo)降解效力和代謝穩(wěn)定性，而靈活的連接基則在靜脈注射的 DT-2216 中表現(xiàn)較好，DT-2216 的可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量（29個(gè)）遠(yuǎn)超可接受的范圍，但其高度靈活性適合非口服給藥。

03 Optimization and Challenges

口服 PROTAC 的生物利用度設(shè)計(jì)面臨顯著挑戰(zhàn)。由于 PROTAC 的三部分結(jié)構(gòu)，使分子量低于約 700 Da 的設(shè)計(jì)難以實(shí)現(xiàn)，這通常違反了 Lipinski 的分子量規(guī)則，同時(shí)保持其他 Ro5 標(biāo)準(zhǔn)（如 HBA、HBD、logP）和物理化學(xué)描述符（如 PSA、可旋轉(zhuǎn)鍵）在可接受范圍內(nèi)也具有難度。盡管如此，PROTAC 已在臨床前研究和人體實(shí)驗(yàn)中顯示出一定的生物利用度，能夠達(dá)到有效的藥物暴露水平。

隨著 PROTAC 的不斷探索，藥物化學(xué)家積累了關(guān)鍵的物理化學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)，提供了新的設(shè)計(jì)見(jiàn)解。Arvinas 和 AstraZeneca 的研究表明，口服吸收的關(guān)鍵在于減少溶劑暴露的氫鍵供體（eHBD）數(shù)量，兩者均獨(dú)立得出 eHBD≤2 的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，即便分子量、親脂性、極性和 HBA 等物理化學(xué)性質(zhì)超過(guò)了傳統(tǒng)的 Ro5 限值。相關(guān)研究表明，對(duì)于大環(huán) bRo5 藥物，酰胺類(lèi) HBD 的數(shù)量應(yīng)不超過(guò) 2，但正式 HBD 數(shù)量可更高，總計(jì)不超過(guò) 7 個(gè)。CRBN 結(jié)合基序的小分子特點(diǎn)也符合 eHBD≤2 的標(biāo)準(zhǔn)，這種設(shè)計(jì)使口服 PROTAC 達(dá)到有效生物利用度成為可能，盡管面臨挑戰(zhàn)。合理分配“分子特性預(yù)算”，尤其是控制 HBD 數(shù)量，是 PROTAC 設(shè)計(jì)成功的關(guān)鍵因素。

The three-body problem

PROTAC 的靶向蛋白質(zhì)降解功能依賴(lài)于三元復(fù)合物的有效形成，這種復(fù)合物能夠促進(jìn)表面賴(lài)氨酸的泛素化。然而，由于可能存在多種構(gòu)象且并非所有構(gòu)象都能導(dǎo)致降解，三元復(fù)合物的建模十分具有挑戰(zhàn)性。PROTAC 的大型分子結(jié)構(gòu)及 POI-linker-E3 組分的相互作用，使得其設(shè)計(jì)需要更高的“化學(xué)公平性”，以確保活性。鑒于形成有效三元復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)仍不明確，生成活性 PROTAC 需要克服設(shè)計(jì)與合成的重重障礙。

為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，藥物化學(xué)家已采用“庫(kù)”的生成方法，通過(guò)廣泛的化學(xué)空間探索，以經(jīng)驗(yàn)性手段找到可行的組合。開(kāi)發(fā)“PROTAC 工具箱”也提供了一種靈活的篩選方法，包含多種 E3 連接酶、配體和接頭的組合，以找到理想的異雙功能分子�；钚� PROTAC 隨后需進(jìn)一步優(yōu)化以提升降解效率及改善物理化學(xué)性質(zhì)。當(dāng)前的化學(xué)研究表明，PROTAC 中的線性接頭逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀、構(gòu)象受限版本，以平衡溶解度和細(xì)胞滲透性，這也成為設(shè)計(jì)的共同趨勢(shì)。

為提高篩選效率并減少浪費(fèi)，研究人員還開(kāi)發(fā)了“直接生物學(xué)”或“納米 SAR”方法，以便在細(xì)胞中直接篩選納摩爾級(jí)的非純化庫(kù)，為 PROTAC 的快速、高效和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)的發(fā)現(xiàn)提供了新思路。

Shape shifting chimeras

PROTAC 的三部分組成和分子大小使其在構(gòu)象理解上比傳統(tǒng)小分子更具挑戰(zhàn)性。藥物化學(xué)中常用的策略是通過(guò)預(yù)先組織分子以采取生物活性構(gòu)象，從而減少結(jié)合時(shí)的熵懲罰。然而，PROTAC 的配體由于具備較大的構(gòu)象自由度，加之三元復(fù)合物周?chē)�的�?gòu)象可塑性和不確定性，使得模仿哪種“生物活性”構(gòu)象成為一大難題。

結(jié)合 NMR 技術(shù)和分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬的研究表明，PROTAC 的構(gòu)象行為和滲透性在極性（如重水或 DMSO-d6）與非極性溶劑（如 CDCl3）中存在差異。這些差異揭示了構(gòu)象集合、端到端回折及潛在分子內(nèi)氫鍵 (IMHB) 的信息，被稱(chēng)為“變色龍”分子內(nèi)折疊。與未折疊的分子相比，折疊狀態(tài)的 CRBN 和 VHL 結(jié)合 PROTAC 顯示出更高的被動(dòng)細(xì)胞滲透性。而對(duì)具有更剛性連接基的 PROTAC（如 ARV-110、ARV-766、ARV-471 和 KT-474）的研究則表明，在不同溶劑中，延伸的構(gòu)象異構(gòu)體更為穩(wěn)定。

The world must be measured by eye

PROTAC 領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于，傳統(tǒng)小分子優(yōu)化程序的體外檢測(cè)方法是否能為 PROTAC 提供有意義的數(shù)據(jù)。這些較大的、親脂性較強(qiáng)的分子易附著在實(shí)驗(yàn)器皿、蛋白質(zhì)或膜上，導(dǎo)致滲透性和蛋白結(jié)合檢測(cè)中的回收率不佳。同時(shí)，傳統(tǒng)的搖瓶法難以檢測(cè)出 logD 值大于 4 的化合物，而溶解度也往往低于檢測(cè)限，使得缺乏數(shù)據(jù)的候選物分類(lèi)變得更具挑戰(zhàn)性。盡管如此，代謝穩(wěn)定性測(cè)試（如肝細(xì)胞和微粒體孵育）對(duì)篩除不穩(wěn)定的 PROTAC 提供了有價(jià)值的指標(biāo)。

為改進(jìn) PROTAC 的優(yōu)化，研究者已借鑒 bRo5 領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)色譜法（ChromlogD 和 ePSA）拓展了測(cè)量的親脂性和極性范圍，并結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬來(lái)生成相關(guān)的 3D 描述符，從而提升設(shè)計(jì)成功率。此外，在 FaSSIF 和 FeSSIF 等生物相關(guān)溶液中的溶解度測(cè)量和“預(yù)飽和”法為游離水平的估計(jì)提供了更準(zhǔn)確的方式。盡管 PROTAC 的親脂性較傳統(tǒng)小分子藥物（logD 1-3）更高（13 種臨床 PROTAC 中 9 種的 logD≥3），但最終的藥代動(dòng)力學(xué)特征仍需通過(guò)體內(nèi)評(píng)估在高等動(dòng)物模型、毒性研究乃至人體中進(jìn)一步驗(yàn)證。

Pitfalls to avoid

將 CRBN 結(jié)合實(shí)體（尤其是 IMiD）整合到 PROTAC 中帶來(lái)了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)源于 PROTAC 可能充當(dāng)分子膠水降解劑 (MGD)，引發(fā)多種蛋白質(zhì)（新底物）降解，導(dǎo)致毒理學(xué)效應(yīng)。例如，新底物 GSPT1 是一個(gè)翻譯終止因子，其降解可能會(huì)降低蛋白質(zhì)合成率并引發(fā)細(xì)胞毒性，而誤導(dǎo)性地掩蓋目標(biāo) POI 的實(shí)際降解情況。此外，不僅 CRBN 配體具有 MGD 活性，其他 E3 連接酶如 VHL 的配體也表現(xiàn)出類(lèi)似特性。一些 PROTAC 甚至顯示出源于 POI 配體的 MG 活性，如一款 JQ1 衍生的 PROTAC 就通過(guò) DCAF16 而非預(yù)期的 DCAF15 降解 BRD4，凸顯了嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的重要性，以確保 PROTAC 的機(jī)制安全有效。

在發(fā)現(xiàn)階段到體內(nèi)評(píng)估過(guò)程中，理解 PROTAC 的代謝命運(yùn)同樣至關(guān)重要。即便代謝穩(wěn)定的 PROTAC，其代謝產(chǎn)物往往更具極性和較低親脂性，可能降低三元復(fù)合物的有效性，進(jìn)而削弱體內(nèi)療效。此外，盡管精心設(shè)計(jì)避免 MGD 活性，CRBN 結(jié)合 PROTAC 的代謝物仍可能具備 MGD 活性，從而帶來(lái)潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，當(dāng)前臨床試驗(yàn)對(duì)這些風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估將幫助確定 CRBN 基 PROTAC 是否適用于非腫瘤適應(yīng)癥。

04 Conclusions

PROTAC 模式已實(shí)現(xiàn)了其最初的靶向蛋白質(zhì)降解的承諾，多個(gè)高質(zhì)量的降解劑已進(jìn)入臨床評(píng)估階段，尤其是在腫瘤治療領(lǐng)域，并以 CRBN 為首選 E3 連接酶。初步數(shù)據(jù)表明，PROTAC 在人體中具備生物學(xué)效能和口服生物利用度，進(jìn)一步驗(yàn)證了其應(yīng)用潛力。在結(jié)構(gòu)已公開(kāi)的 PROTAC 中，常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)特征如堿基和富環(huán)連接子，以及 eHBD≤2 等物理化學(xué)參數(shù)，為設(shè)計(jì)提供了寶貴的參考。

PROTAC 以及其他大分子候選藥物的出現(xiàn)，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng) Ro5 規(guī)則，表明某些規(guī)則可以被重新審視甚至突破。與類(lèi)似的創(chuàng)新性例子一同，PROTAC 正在重新定義“口服生物可利用化學(xué)空間”，表明在探索新領(lǐng)域的邊界時(shí)，應(yīng)保持開(kāi)放態(tài)度，同時(shí)避免簡(jiǎn)單地對(duì)化學(xué)設(shè)計(jì)設(shè)定新的限制。