在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)用的實(shí)驗(yàn)就是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)非常重要。實(shí)驗(yàn)室用最多的應(yīng)該是永久性細(xì)胞株，涉及的就是細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞傳代）、細(xì)胞復(fù)蘇和細(xì)胞凍存。在這里，說明永久性細(xì)胞株的培養(yǎng)，原代細(xì)胞的培養(yǎng)相對難些，要求也更高。

以25cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶為例：

1、細(xì)胞復(fù)蘇

（1）預(yù)先對超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒滅菌；同時(shí)，開啟水浴鍋，將溫度設(shè)定為37 ℃，并將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至37 ℃水浴鍋中快速搖動(dòng)，直至凍存液全部融解。(切記要快速轉(zhuǎn)移）
（2）將凍存管中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL Ep管中，800~1000 rpm離心5 min。棄上清液，使用含10 %胎牛血清的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至專用的無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，再加入3~4 mL培養(yǎng)基，使用移液槍輕輕吹打均勻。
（3）顯微鏡下觀察，以細(xì)胞分散均勻不成團(tuán)為標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)記細(xì)胞瓶后，放置培養(yǎng)箱中。

注意：有些實(shí)驗(yàn)室使用的不是1.5 mL Ep管，有可能是15mL 的離心管，可在離心管中加入8-9 mL的新培養(yǎng)基再離心；如果是用細(xì)胞皿，操作也是相同的，根據(jù)細(xì)胞皿加對應(yīng)體積的新培養(yǎng)基；還有一些實(shí)驗(yàn)室是不離心，直接將凍存液加新培養(yǎng)基培養(yǎng)的，這種方法也可以，建議細(xì)胞貼壁后及時(shí)更換培養(yǎng)液。

2、細(xì)胞傳代

（1）當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞匯合率大概達(dá)到80 %，即可進(jìn)行傳代；棄舊培養(yǎng)液，使用室溫的PBS潤洗細(xì)胞的貼壁生長面2次，每次2 mL，使用移液槍小心吸盡殘液；
（2）再加入1 mL的胰酶（0.25%），輕微搖動(dòng)細(xì)胞瓶，確保胰酶能覆蓋所有細(xì)胞，顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始皺縮時(shí)棄胰酶；再加入2 mL完全培養(yǎng)基并輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞全部下來后，可再輕緩吹打細(xì)胞懸液，直至顯微鏡下觀察到細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。
（3）根據(jù)后續(xù)的細(xì)胞密度與實(shí)驗(yàn)需求，棄去多余的細(xì)胞液或按比例擴(kuò)大培養(yǎng)，再加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹打均勻后將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

注：有些實(shí)驗(yàn)室會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，把加入胰酶的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，可加快胰酶的酶解速度，具體根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況。

3、細(xì)胞凍存

（1）當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞匯合率大概達(dá)到80 %，利用細(xì)胞傳代的方法，將吹打均勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，800~1000 rpm離心5 min；
（2）準(zhǔn)備好細(xì)胞凍存管，并在凍存管中配好凍存液（胎牛血清：DMSO=4：1）；取1 mL完全培養(yǎng)基將離心的細(xì)胞重懸，然后取500uL的細(xì)胞重懸液加入凍存管，吹打混勻；
（3）在凍存管上做好標(biāo)記，如細(xì)胞全稱、凍存日期等；將凍存管放入細(xì)胞凍存盒中，放入-80 ℃冰箱中進(jìn)行緩慢降溫，24 h后即可轉(zhuǎn)移至液氮罐中儲(chǔ)存。

注：市面上有配好的凍存液，不差錢的建議直接買現(xiàn)成的。

4、細(xì)胞計(jì)數(shù)

（1）提前用酒精棉球?qū)⒓?xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片擦拭干凈，并晾干備用；
（2）利用細(xì)胞傳代的方法，使用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，并在計(jì)數(shù)板上滴入細(xì)胞懸液（可適當(dāng)稀釋降低細(xì)胞密度）；
（3）在光學(xué)顯微鏡下，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，只計(jì)算左上或右下兩側(cè)的壓線細(xì)胞數(shù)。然后計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù) / 4×104(每個(gè)大格的體積為0.1 mm3，而1 mL=1000 mm3)；依據(jù)實(shí)驗(yàn)安排以及得到的細(xì)胞數(shù)與體積比，對細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋。