介紹: 
DNA標(biāo)記/QTL（基因）發(fā)現(xiàn)和標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的最新進(jìn)展對(duì)通過(guò)標(biāo)記輔助選擇對(duì)作物改良具有重大影響。為了在植物育種中發(fā)現(xiàn)和利用DNA標(biāo)記，建立低成本、高通量、大規(guī)模、可靠和靈活的標(biāo)記基因分型平臺(tái)是關(guān)鍵因素之一。為SNP基因分型平臺(tái)（如TaqMan和KASP分析）實(shí)施高通量工作流程需要準(zhǔn)確分配檢測(cè)預(yù)混液和試劑。速度和準(zhǔn)確性是實(shí)現(xiàn)所需檢測(cè)性能的關(guān)鍵因素，同時(shí)利用使試劑使用最小化的工作流程以進(jìn)行大規(guī)模研究。 

在此，我們展示了MANTIS儀器在我們的大豆計(jì)劃中的DNA標(biāo)記/QTL發(fā)現(xiàn)和分子育種過(guò)程中的應(yīng)用。

材料: 
MANTIS是一款易于編程、低容量、低死體積、非接觸式的試劑分配器。MANTIS可以配置多達(dá)（6）種不同的試劑，分配范圍為100 nL - 2 mL，可以將任何體積的試劑分配到任何孔中，并與任何密度高達(dá)1536的平板兼容。

為了盡量減少死體積，試劑可以直接插入微流控芯片。通過(guò)使用移液器吸頭作為加樣槽，死體積可以進(jìn)一步減少到6μL。這一功能非常適合分配昂貴的PCR試劑。

MANTIS®的核心是一個(gè)獲得專(zhuān)利的微流體閥組，用于測(cè)量和分配離散體積液體。壓力和真空打開(kāi)和關(guān)閉硅閥組上的每個(gè)閥門(mén)。每個(gè)芯片都有兩個(gè)微型隔膜（100納升/500納升或1微升/5微升），可以以每秒10次的速度填充和分配。Mantis的整個(gè)流體路徑是一次性的，以消除交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

MANTIS®軟件提供了一個(gè)易于使用、用戶友好的方式來(lái)設(shè)計(jì)和運(yùn)行您的檢測(cè)。只需將試劑添加到分配列表中，定義體積，并在虛擬板上點(diǎn)選以定義您希望試劑分配的位置。MANTIS軟件能夠設(shè)計(jì)梯度和回填，此外還能夠?qū)��?txt和.csv的分配列表。

方法: 
從CX1512-44來(lái)源分離FAD3A和FAD3C基因的兩個(gè)BC1F2種群。從溫室種植的幼苗或田間種植的植物中收集葉子樣品并排列在96孔板中。將葉樣品在550°C下干燥24小時(shí)，并在管中使用帶有單個(gè)BB(Daisy，Rogers AK)的GenoGrinder以1600rpm研磨2分鐘。然 后從葉粉中提取DNA。

TaqMan分析引物和探針使用Primer Express 3.0.1軟件設(shè)計(jì)，以檢測(cè)FAD3A和FAD3C (CX1512-44) 中的突變SNP。所有檢測(cè)均由一對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增范圍為141-167 bp的擴(kuò)增子和兩個(gè)分別用VIC(野生型)和FAM(突變型)染料標(biāo)記的含SNP的探針組成。

PCR反應(yīng)在4.0µL的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行，其中含有2µL樣品DNA、2µL2×TaqMan Universal預(yù)混液(Life Technologies, Carlsbad CA)和0.2µL 5×分析混合物(每種引物的終濃度為0.255µM，每個(gè)探針的終濃度為0.05µM)。使用Mantis試劑分配器將預(yù)混液和分析混合物分配到含有樣品的384孔板中。

PCR后，用Tecan M1000 Pro Infinite Reader(Tecan Group Ltd，Morrisville NC)讀取孔板，并將輸出文件導(dǎo)入Kluster Caller 軟件，以實(shí)現(xiàn)集群的可視化和SNP調(diào)用。

結(jié)論: 
大豆種子油的成分，特別是棕櫚酸、油酸和亞麻酸，由于其營(yíng)養(yǎng)的重要性和工業(yè)應(yīng)用，對(duì)消費(fèi)者來(lái)說(shuō)具有巨大的利益。培育高油酸和低亞麻酸的大豆栽培品種成為重要的育種目標(biāo)之一。我們開(kāi)發(fā)的用于選擇某些來(lái)源的有利油脂成分的SNP TaqMan標(biāo)記檢測(cè)在分離野生型、突變體和雜合子方面非常有效。在基因分型過(guò)程中，借助于Mantis試劑分配器，我們建立了這個(gè)基因分型工作流程，它是準(zhǔn)確、高效和具有成本效益的。因此，該檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于大豆育種項(xiàng)目，以促進(jìn)脂肪酸性狀的標(biāo)記輔助選擇，并提高了效率和精度。