原創(chuàng)：右邊 文章來(lái)源于：生信人

2017年FDA批準(zhǔn)諾華公司的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品上市，為難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的治療帶來(lái)了莫大的希望，那么CAR-T治療的原理是什么呢？

首先我們來(lái)溫習(xí)一點(diǎn)免疫學(xué)知識(shí)，T細(xì)胞通過(guò)表面受體TCR與細(xì)胞表面的MHC分子遞呈的抗原相結(jié)合，以識(shí)別不同的細(xì)胞。但是腫瘤細(xì)胞通過(guò)減少或者缺失MHC的表達(dá)以逃脫T細(xì)胞對(duì)其識(shí)別和殺傷作用，這稱為免疫逃逸。而CAR-T是給患者的T細(xì)胞安裝上嵌合抗原受體，也就是CAR，相當(dāng)于給T細(xì)胞安裝上導(dǎo)航，重新賦予T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力。

CAR-T中的T一般指的是αβT，這又是什么意思呢？T細(xì)胞表面有T細(xì)胞受體(TCR)，可以識(shí)別和結(jié)合抗原提呈細(xì)胞呈遞的抗原，TCR由兩條多肽鏈組成（聯(lián)想一下工具鉗子），每條鏈分為可變區(qū)(V，也就是鉗子頭的前1/2)和恒定區(qū)(C，也就是鉗子頭的后1/2和鉗子把)�？勺儏^(qū)與抗原肽結(jié)合，恒定區(qū)參與信號(hào)傳導(dǎo)。TCR的兩條肽鏈通過(guò)二硫鍵連接，形成抗原肽結(jié)合溝槽（也就是鉗子的的連接處）。TCR的兩條肽鏈有α、β、γ、δ四種，其中α/β鏈存在于輔助性T細(xì)胞Th和細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面，占T細(xì)胞的95%，而γ/δ鏈則存在于其他類型的T細(xì)胞表面‌，占T細(xì)胞的5%。

那么為什么CAR-T治療選擇了αβT，而不是γδT細(xì)胞呢？它們除了數(shù)量，還有什么差別呢？接下來(lái)就有請(qǐng)今天的主角：αβT和γδT細(xì)胞。

等會(huì)兒，在讀正文之前，我們先用通俗易懂的話來(lái)復(fù)習(xí)幾個(gè)學(xué)過(guò)的概念：

①主要組織相容性復(fù)合體MHC：它其實(shí)就是抗原識(shí)別的中介，它作為中介，是沒(méi)有對(duì)抗抗原，也就是病毒、細(xì)菌的能力的，所以它需要帶著細(xì)菌、病毒去找大佬，以殺死細(xì)菌和病毒等抗原。MHC主要分為MHC-I和MHC-II。MHC-I幾乎表達(dá)在所有有核細(xì)胞表面，如果這些細(xì)胞已經(jīng)被細(xì)菌、病毒感染了，那么MHC-I就能識(shí)別到，然后帶著這個(gè)感染的細(xì)胞去找細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），從而清除被細(xì)菌病毒感染的細(xì)胞。而MHC-II主要表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等表面，這些細(xì)胞可不是一般的細(xì)胞，當(dāng)MHC-II識(shí)別到細(xì)胞外有細(xì)菌、病毒，就帶著這些細(xì)胞去吃掉它們，再去找輔助性T細(xì)胞（Th）幫忙清除細(xì)菌和病毒。進(jìn)而激活體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

②細(xì)胞免疫和體液免疫：說(shuō)回剛才的MHC，MHC-I直接帶著細(xì)菌病毒去找大佬（細(xì)胞毒性T細(xì)胞），激活的就是細(xì)胞免疫。而MHC-II是有帶著B細(xì)胞去吃掉細(xì)菌病毒，再去找大佬的（輔助性T細(xì)胞），這時(shí)候B細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抗體，那么激活的就是體液免疫，但是MHC-II也帶著巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞去了哦，所以也激活了細(xì)胞免疫。

③先天免疫和適應(yīng)性免疫：先天免疫又稱為非特異性免疫或內(nèi)在免疫，是機(jī)體遇到病原體攻擊是最先站出來(lái)反擊的，積極參與先天免疫的是吞噬細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等。適應(yīng)性免疫又稱特異性免疫或獲得性免疫，主要由B和T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)，它們接收并清除抗原提呈細(xì)胞帶來(lái)的抗原（也就是病原體），引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。

④MHC限制性：無(wú)規(guī)矩不成方圓，免疫系統(tǒng)也要各司其職，不能認(rèn)領(lǐng)別人的功勞，T細(xì)胞在清除MHC帶來(lái)的細(xì)菌病毒時(shí)，要看看是誰(shuí)帶來(lái)的，如Th細(xì)胞只識(shí)別MHC-II類分子，而CTL細(xì)胞只識(shí)別MHC-I類分子，這就叫MHC限制性。

讀到這里，有意思的事情發(fā)生了，Th細(xì)胞和CTL細(xì)胞是受MHC限制的，而這兩種細(xì)胞都是αβT細(xì)胞。那么γδT細(xì)胞是不是不受MHC限制呢？那它對(duì)抗原的反應(yīng)性是不是就更高了呢？那用它去清除細(xì)菌、病毒、腫瘤的效果是不是更好呢？那么為什么還要選擇αβT細(xì)胞作為CAR-T治療的對(duì)象呢？讓我們帶著問(wèn)題進(jìn)入正文。

一、CAR-T細(xì)胞

1、CAR-T的構(gòu)建原理

目前CAR-T治療使用的T細(xì)胞指的是αβT細(xì)胞，我們首先來(lái)了解一下CAR-T構(gòu)建的原理（圖1）。當(dāng)T細(xì)胞遇到抗原呈遞細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞時(shí)，T細(xì)胞受體（TCR）和CD3復(fù)合物與CD4或CD8一起識(shí)別MHC復(fù)合物呈遞的肽，然后觸發(fā)TCR信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞活化（圖1A）。第一代CAR主要涉及兩部分：細(xì)胞外部分的scFv和細(xì)胞內(nèi)部分的CD3ζ鏈。ScFv結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別腫瘤表面抗原，CD3ζ鏈會(huì)直接激活T細(xì)胞。第二代CAR包含一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，即4-1BB或CD28信號(hào)結(jié)構(gòu)域。第三代CAR具有4-1BB和CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（圖1B）。這些結(jié)構(gòu)的增加加強(qiáng)了細(xì)胞因子產(chǎn)生和響應(yīng)靶標(biāo)刺激的增殖，降低了CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。FDA批準(zhǔn)的6種CAR-T產(chǎn)品均采用第二代 CAR 構(gòu)建體，由抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、共刺激結(jié)構(gòu)域和T細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。這些產(chǎn)品用于治療B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤（圖1C）。

2、CAR-T細(xì)胞治療的挑戰(zhàn)和攻克實(shí)體瘤的工程策略

近年來(lái)，人們投入了大量精力來(lái)改進(jìn)實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法，目前已在血液腫瘤中取得了可喜的成績(jī)。但是，雖然在實(shí)體瘤中顯示出活性跡象，但迄今為止臨床試驗(yàn)的結(jié)果令人失望，沒(méi)有觀察到持續(xù)較高的持久反應(yīng)率。

究其原因，治療實(shí)體瘤對(duì) CAR-T 細(xì)胞構(gòu)成了三大挑戰(zhàn)：腫瘤異質(zhì)性、腫瘤浸潤(rùn)和抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）。腫瘤抗原有兩種類型，一種是僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤特異性抗原 （TSA） 和也可以在正常細(xì)胞中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原 （TAA）。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可能在不同水平表達(dá)腫瘤抗原。要克服異質(zhì)性，重點(diǎn)時(shí)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)靶向。研究人員設(shè)計(jì)了具有兩種不同 scFv （TanCAR） 的 CAR 或表達(dá)兩種識(shí)別不同抗原的不同 CAR （雙特異性 CAR），還探索了CAR-T 細(xì)胞的額外修飾以增強(qiáng)其靶向能力，使 CAR-T 細(xì)胞能夠分泌雙特異性 T 細(xì)胞接合器，后者連接腫瘤抗原和 CD3 復(fù)合物以啟動(dòng) T 細(xì)胞腫瘤殺傷。實(shí)體瘤還具有限制 CAR-T 細(xì)胞浸潤(rùn)的物理屏障和細(xì)胞外基質(zhì)。為了克服這一挑戰(zhàn)，研究人員嘗試了 CAR-T 細(xì)胞的局部遞送、工程化表達(dá)趨化因子受體的 CAR、靶向蛋白酶成纖維細(xì)胞活化蛋白 （FAP）的 CAR 或細(xì)胞外基質(zhì) （ECM）修飾的 CAR-T 或溶瘤病毒。免疫抑制性 TME 是另一個(gè)重大挑戰(zhàn)，包括抑制性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫抑制因子（如 TGF-β）以及化學(xué)環(huán)境改變。研究人員使用基因缺失、抗 PD-1/PD-L1 抗體或 T 細(xì)胞自分泌抗體來(lái)阻斷 PD-1 等免疫檢查點(diǎn)，還設(shè)計(jì)了表達(dá)細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體的 CAR，用 PD-1 或 TGF-β 中的激活結(jié)構(gòu)域代替抑制結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)換受體，并刪除 T 細(xì)胞內(nèi)負(fù)調(diào)節(jié)因子或過(guò)表達(dá) T 細(xì)胞功能增強(qiáng)劑來(lái)增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤功能（圖2）。

3、CAR-T的副作用

盡管 CAR-T 療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了臨床成功，但仍然有危及生命的副作用，例如① CRS 和②神經(jīng)毒性。

①CRS 是一種全身性疾病，在最嚴(yán)重的病例中表現(xiàn)為全身癥狀、發(fā)熱、低血壓和器官功能障礙，它由細(xì)胞因子的大量釋放引發(fā)，IL-1 和 IL-6、CAR-T 細(xì)胞和 TME 細(xì)胞在癌細(xì)胞識(shí)別后起著關(guān)鍵的致病作用。

②神經(jīng)毒性，也稱為免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），是一種中毒性腦病，臨床上與 CRS 的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

因此研究人員致力于開發(fā)新的CAR-免疫治療，例如CAR-γδT細(xì)胞、CAR-NK細(xì)胞、CAR-巨噬細(xì)胞等。今天我們要介紹的是CAR-γδT細(xì)胞。

二、γδT細(xì)胞的研究

γδT細(xì)胞是一種進(jìn)化保守的T細(xì)胞系，它可連接先天免疫和適應(yīng)性免疫，比αβT細(xì)胞亞群具有更廣泛的反應(yīng)性。此外，γδT細(xì)胞不受個(gè)體主要組織相容性復(fù)合體分子的限制，“現(xiàn)成的”治療性γδT細(xì)胞生物庫(kù)有能力從健康供體中產(chǎn)生，因此γδT細(xì)胞有望用于下一代免疫療法，以覆蓋更多樣化的患者群體，并可能減少不良反應(yīng)。

一、γδT細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)

相對(duì)于αβT細(xì)胞，γδT細(xì)胞因其在橋接先天免疫和適應(yīng)性免疫方面的獨(dú)特作用而脫穎而出。它們靶向并殺死癌細(xì)胞，不受主要組織相容性復(fù)合體 （MHC） 分子的限制，并且許多亞群自然定位于組織并在組織內(nèi)發(fā)揮作用，容易識(shí)別新抗原載量低的腫瘤，識(shí)別到癌癥表面抗原的潛在多樣性，因此對(duì)癌細(xì)胞有更廣泛的識(shí)別，包括那些缺乏 MHC I 類的細(xì)胞。γδT 細(xì)胞擅長(zhǎng)分泌干擾素γ （IFN-γ） 和腫瘤壞死α因子 （TNF-α） 等細(xì)胞因子，它們可以通過(guò) Fas/FasL 和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 （ADCC） 等機(jī)制直接消除腫瘤細(xì)胞，它們能夠遷移到外周組織并對(duì)靶細(xì)胞快速反應(yīng)，再加上它們通過(guò)協(xié)調(diào)CD 8 +αβT細(xì)胞記憶的能力，向αβT細(xì)胞交叉遞呈肽抗原，并且它們不參與移植物抗宿主病（GvHD），使其成為現(xiàn)成細(xì)胞治療解決方案的理想選擇（表1）。

二、γδT細(xì)胞是天然的CAR-T細(xì)胞之選的原因

1、γδTCR在識(shí)別天然抗原方面的功能與抗體類似（抗體樣識(shí)別），但由于TCRδ V-D-J基因片段重組可以實(shí)現(xiàn)多樣性，因此腫瘤靶點(diǎn)的范圍可能更廣泛，包括以高水平表達(dá)和/或多種不同癌癥的形態(tài)改變的自身表面抗原（表2）。

2、γδT細(xì)胞將抗體樣識(shí)別與顆粒酶和穿孔素的高表達(dá)相結(jié)合，促進(jìn)了靶細(xì)胞溶解，而不需要攜帶FcR的輔助細(xì)胞，有一定的向αβT細(xì)胞遞呈抗原的能力，以及激活自然殺傷細(xì)胞受體（NKR）的表達(dá)，包括天然細(xì)胞毒性受體和FcR，可以補(bǔ)充TCRγδ介導(dǎo)的癌細(xì)胞識(shí)別。

三、γδ T細(xì)胞識(shí)別抗原的獨(dú)特機(jī)制

我們?cè)诿庖邔W(xué)課本上學(xué)到的T細(xì)胞識(shí)別抗原的機(jī)制都是抗原結(jié)合在抗原提呈細(xì)胞例如MHC的胞外段，繼而提呈并活化T細(xì)胞（其實(shí)課本中的T細(xì)胞是指αβT細(xì)胞，機(jī)制就如正文前概念①所述）。而γδ T細(xì)胞具有自己獨(dú)特的抗原識(shí)別方式，它不依賴于MHC，那它是怎么識(shí)別的呢？研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和病原體都能產(chǎn)生一類被稱為“磷酸抗原pAg”的脂類代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)能夠激活人體外周血中最大類的γδ T細(xì)胞，也就是Vγ9Vδ2 T細(xì)胞（人血液中的γδT細(xì)胞大多使用Vδ2鏈，它通常與Vγ9鏈配對(duì)。Vγ9Vδ2 T細(xì)胞占外周血γδ T細(xì)胞的50-95%）。

具有胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜乳糜蛋白BTN3A充當(dāng)了磷酸抗原的遞呈分子，晶體學(xué)證據(jù)表明磷酸抗原與BTN3A1的細(xì)胞內(nèi)B30.2結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，形成了與BTN2A1直接結(jié)合的復(fù)合界面，形成了以磷酸抗原分子為中心，周圍以不同的親和力粘合BTN3A的結(jié)構(gòu)。從而觸發(fā)細(xì)胞外構(gòu)象變化，使靶細(xì)胞能夠被Vγ9Vδ2 T細(xì)胞識(shí)別并啟動(dòng)T細(xì)胞免疫，進(jìn)而殺滅病原和腫瘤細(xì)胞。這種“由內(nèi)而外”的信號(hào)傳導(dǎo)模式幫助磷酸抗原激活了γδ T細(xì)胞（圖3）。羥甲基丁二烯基焦磷酸（HMBPP）是一種外源性磷酸抗原，異戊烯二磷酸（DMAPP）和異戊二烯二磷酸（IPP）在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中積聚。HMBPP激活Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的能力比后兩種強(qiáng)很多。

三、“現(xiàn)成“的療法

為什么說(shuō)是“現(xiàn)成”的呢？這是因?yàn)?gamma;δT細(xì)胞不受MHC限制，因此它們可以作為同種移植物進(jìn)行輸血，幾乎沒(méi)有發(fā)生移植物抗宿主�。℅VAR）的危險(xiǎn)，而GVAR會(huì)混淆同種異基因αβT細(xì)胞療法。因此γδ過(guò)繼細(xì)胞療法（ACT）可以提前從健康捐贈(zèng)者中準(zhǔn)備好并現(xiàn)貨給藥。

研究人員成功利用了γδT細(xì)胞識(shí)別抗原的獨(dú)特機(jī)制設(shè)計(jì)免疫治療藥物，開發(fā)了人類γδT細(xì)胞功能的小分子激活劑和抑制劑。例如，在中國(guó)濟(jì)南復(fù)大腫瘤醫(yī)院進(jìn)行的同種異體Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的I期試驗(yàn)中，安全性得到證實(shí)，18名接受5次或5次以上輸注的晚期肝癌或肺癌患者的生存期大大延長(zhǎng)（NCT03183206，NCT03183219，NCT03183232，NCT03180437）。由于Vγ9Vδ2 T細(xì)胞數(shù)量有限，Vγ9Vδ2 T細(xì)胞激活與αβT細(xì)胞激動(dòng)相比不太可能引起不良事件�；�于BTN3A分子在Vγ9Vδ2 T細(xì)胞活化中的作用，ImCheck Therapeutics （Marseille, France）開發(fā)了BTN3A特異性激動(dòng)劑抗體，替代磷酸抗原驅(qū)動(dòng)TCR活化。有證據(jù)表明，在用Vγ9Vδ2 T細(xì)胞重建的異種移植物模型中有腫瘤抑制作用，一種抗體（ICT0）已經(jīng)在血液腫瘤和實(shí)體瘤的I/IIa期臨床試驗(yàn)中，也取得了不錯(cuò)的結(jié)果（NCT04243499，NCT05307874）。更具有突破性的是，用αβT細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-Vγ9Vδ2 T細(xì)胞已作為針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的ACT應(yīng)用于I期研究（NCT04688853）。表3顯示了正在進(jìn)行的γδT細(xì)胞治療癌癥的臨床試驗(yàn)（包括血液腫瘤和實(shí)體瘤）。

四、基于γδT細(xì)胞的免疫療法的挑戰(zhàn)

由于γδT細(xì)胞在外周血中較少，只占T細(xì)胞的5%，體外擴(kuò)增比較困難，而且目前尚沒(méi)有成熟的方法去解決這個(gè)問(wèn)題。但是有研究發(fā)現(xiàn)，使用唑來(lái)膦酸和白介素-2 (IL-2)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該基因賦予對(duì)替莫唑胺(TMZ)的抗性，替莫唑胺是GBM的標(biāo)準(zhǔn)化療，其通過(guò)引起基因組損傷，可誘導(dǎo)Vγ9Vδ2 T細(xì)胞的TCR和NKR抗原。MGMT轉(zhuǎn)導(dǎo)的Vγ9Vδ2 T細(xì)胞通過(guò)用于TMZ遞送的Rickham導(dǎo)管在殘余腫瘤部位附近給藥。用于Vγ9Vδ2 T細(xì)胞制備和維持的改進(jìn)方法提供了不斷的局部施用細(xì)胞的機(jī)會(huì)。該方法已成功應(yīng)用于四種原發(fā)性和難治性GBM的人-鼠異種移植模型，并已投入臨床應(yīng)用（表3）。

目前基于γδT細(xì)胞的免疫療法仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)γδT細(xì)胞的特點(diǎn)、識(shí)別抗原的獨(dú)特方式來(lái)構(gòu)建適合的CAR分子，并且相關(guān)的研究仍然較少，仍需要投入大量的精力從血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤、CAR-NK細(xì)胞、CAR-巨噬細(xì)胞等進(jìn)行研究。