以人類或動(dòng)物細(xì)胞、組織及體液等生物材料為起始原料生產(chǎn)的生物制品，在其制備流程及制劑階段，可能會(huì)引入人或動(dòng)物源的原材料及輔助物質(zhì)。這些起始原料、添加的原材料以及所使用的輔料，均存在遭受病毒污染的潛在威脅。

為了有效控制生物制品受病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)均出臺(tái)相關(guān)法規(guī)，強(qiáng)制要求生物制品的生產(chǎn)流程必須包含能夠有效滅活或去除病毒的工藝步驟，以此來確保最終產(chǎn)品的生物安全性。

病毒污染是構(gòu)成治療用生物制品安全性的重大威脅之一。歷史上，由于缺乏對(duì)病毒污染風(fēng)險(xiǎn)的充分認(rèn)知，加之病毒檢測(cè)技術(shù)與病毒滅活/去除手段存在局限性，血源性生物制品以及通過工程細(xì)胞與工程細(xì)菌表達(dá)生產(chǎn)的生物制品在生產(chǎn)流程中曾遭遇嚴(yán)重病毒污染事件。Table 1列舉了部分歷史上生物制品遭受病毒污染的典型案例。

Table 1. 歷史上生物制品病毒污染案例

隨著對(duì)生物制品病毒安全控制要求的不斷提升，基于各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)與業(yè)界長(zhǎng)期積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，一系列針對(duì)生物制品病毒安全控制與評(píng)估的法規(guī)和技術(shù)規(guī)范相繼出臺(tái)。以下是本文在撰寫過程中主要參考的相關(guān)法規(guī)：

1）生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)的技術(shù)審評(píng)一般原則，藥品評(píng)審中心，2005

2）血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則，NMPA，2002

3）《中國(guó)藥典》三部，生物制品通則-生物制品病毒安全性控制，2020

4）ICH Q5A（R1）：來源于人或動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評(píng)價(jià)，ICH，1999

5）Technical Report No.83-Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019

6）Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. FDA. 2011

根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版三部通則的最新要求，生物制品在病毒安全性控制方面需特別關(guān)注以下幾類，并采取相應(yīng)的預(yù)防措施：

1）人血液制品：由于原料血漿直接來源于人體，因此感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)較高。對(duì)此類制品，需重點(diǎn)加強(qiáng)人血漿來源的病毒風(fēng)險(xiǎn)控制，并確保生產(chǎn)工藝具備高效的病毒清除能力。具體而言，凝血因子產(chǎn)品需實(shí)施兩步原理不同的病毒去除/滅活步驟，如S/D法和納濾；免疫球蛋白產(chǎn)品則推薦采用低pH孵育和納濾等兩步不同的病毒去除/滅活方法；而白蛋白產(chǎn)品，其下游純化采用的低溫乙醇生產(chǎn)工藝已具備一定的病毒滅活效果，結(jié)合巴氏消毒法可進(jìn)一步確保病毒安全性。必要時(shí)，還需對(duì)上市產(chǎn)品進(jìn)行病毒安全性的追溯。

2）重組治療性生物制品：此類制品需重點(diǎn)關(guān)注工程細(xì)胞基質(zhì)、工程菌、原材料及輔料的病毒污染來源控制，同時(shí)確保生產(chǎn)工藝具備強(qiáng)大的病毒清除能力。

3）動(dòng)物體液/組織來源制品：對(duì)于此類制品，應(yīng)重點(diǎn)考慮起始原材料中動(dòng)物病毒，尤其是人畜共患病毒的風(fēng)險(xiǎn)控制，并確保生產(chǎn)工藝能有效清除病毒。在必要時(shí)，還需對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行病毒污染的檢測(cè)，以確保其安全性。

生物制品的上游污染來源分為內(nèi)源性和外源性病毒污染兩類。內(nèi)源性病毒污染源包括工程細(xì)胞。工程細(xì)胞可能源于人的組織或器官、動(dòng)物的組織或器官、植物的組織或其他來源。這些工程細(xì)胞一旦污染病毒，可能會(huì)帶入到下游工藝，成為病毒污染的源頭。對(duì)于外源性污染源，主要包括物流控制、人員控制、設(shè)施環(huán)境和過程監(jiān)測(cè)。

以工程細(xì)胞來源生物制品為例，確保細(xì)胞庫(kù)無污染是生物制品生產(chǎn)的重中之重。監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)細(xì)胞庫(kù)的污染檢測(cè)有明確嚴(yán)格的要求。細(xì)胞庫(kù)鑒定要求人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系從主細(xì)胞庫(kù)（MCB）、工作細(xì)胞庫(kù)（WCB）到生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC/CAL）的全面的細(xì)胞庫(kù)檢定。對(duì)于未處理收獲液批次放行，要求每個(gè)生產(chǎn)批次收獲的細(xì)胞/未經(jīng)處理的細(xì)胞收獲液（UPB）均需進(jìn)行外源病毒和支原體的檢測(cè)。其他來源生物制品的病毒污染來源分析和風(fēng)險(xiǎn)控制可以此為參考。

在GLP實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，通過應(yīng)用縮小模型，有目的的將一定量的模型病毒添加（即“加標(biāo)”）至未加工的收獲液或各生產(chǎn)步驟的中間體中。這一做法旨在定量評(píng)估滅活/去除病毒工藝步驟的有效性，具體通過測(cè)量病毒在工藝過程中的下降水平來實(shí)現(xiàn)，并據(jù)此確定工藝所能降低的病毒總體水平，以確保產(chǎn)品的安全性。

病毒滅活/去除工藝是保障生物藥品安全性的核心環(huán)節(jié)。根據(jù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的嚴(yán)格規(guī)定，生物制品的生產(chǎn)流程必須包含能有效滅活/去除病毒的工藝步驟。在提交IND/BLA申請(qǐng)時(shí)，必須提供詳盡的病毒清除研究報(bào)告。而在產(chǎn)品上市之后，根據(jù)實(shí)際需求或生產(chǎn)工藝的任何變更，還需對(duì)工藝步驟的有效性進(jìn)行再次驗(yàn)證（Fig.1）。

Fig.1 病毒清除驗(yàn)證時(shí)間

指導(dǎo)原則中明確規(guī)定，一個(gè)典型的驗(yàn)證研究所選病毒應(yīng)全面覆蓋多種類型。具體要求包括：至少應(yīng)包含單鏈和雙鏈的RNA及DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒、強(qiáng)弱抵抗力病毒以及大小顆粒病毒。

綜合相關(guān)法規(guī)要求，模型病毒的選擇應(yīng)遵循以下六項(xiàng)原則：

1）需同時(shí)包含脂包膜病毒與非脂包膜病毒；

2）要涵蓋DNA病毒與RNA病毒；

3）要包括大顆粒病毒與小顆粒病毒；

4）應(yīng)選擇與潛在污染風(fēng)險(xiǎn)相同或相近的病毒；

5）要考慮對(duì)所選滅活/去除方法具有較強(qiáng)抗性的病毒；

6）優(yōu)先選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)人員安全的替代指示病毒。

法規(guī)還進(jìn)一步要求，所選指示病毒應(yīng)盡可能對(duì)人類無致病力，與潛在污染病毒相似且易于體外培養(yǎng)，同時(shí)需適合具體產(chǎn)品特性及工藝特點(diǎn)，并對(duì)驗(yàn)證工藝具有耐受性。

根據(jù)這些要求，用于病毒清除研究的模型病毒可分為三類：相關(guān)病毒（如血液制品相關(guān)的人類病毒）、特異模型病毒（如CHO表達(dá)系統(tǒng)的MuLV和MVM病毒）以及非特異模型病毒（如CHO表達(dá)系統(tǒng)的PRV和Reo3病毒）。在實(shí)際操作中，應(yīng)優(yōu)先選擇與潛在污染病毒密切相關(guān)的病毒，以確保驗(yàn)證研究的有效性和可靠性。

Table 2、Table 3、Table 4分別列出了CHO表達(dá)生物制品、桿狀病毒/SF9表達(dá)系及血液制品中常用的模型病毒及主要特性。

Table 2. CHO表達(dá)系中可選用的模型病毒

Table 3. 桿狀病毒/SF9表達(dá)系中可選用的模型病毒

Table 4. 血液制品中可選用的模型病毒

法規(guī)中關(guān)于病毒滅活/去除有效性評(píng)估的內(nèi)容明確指出了一系列標(biāo)準(zhǔn)，用以衡量工藝步驟的病毒清除效果。

具體而言，若驗(yàn)證研究中的工藝步驟能夠使指示病毒數(shù)量被去除/滅活達(dá)到4個(gè)LRV（Log Reduction Value，對(duì)數(shù)減少值）或以上，則該步驟的病毒滅活/去除效果被視為有效。對(duì)于去除/滅活效果在1至4個(gè)LRV之間的工藝步驟，其病毒滅活/去除效果被認(rèn)定為一般有效。然而，當(dāng)工藝步驟的去除/滅活效果小于1個(gè)LRV時(shí)，其病毒滅活/去除效果則被視為不顯著。值得注意的是，這些不顯著的工藝步驟在評(píng)估總體工藝病毒滅活/去除效果時(shí)，其LRV數(shù)值將不計(jì)入總體工藝的病毒滅活/去除LRV總數(shù)之中，否則可能會(huì)對(duì)清除病毒的實(shí)際能力估計(jì)過高。這些規(guī)定為病毒滅活/去除工藝的有效性和可靠性提供了明確的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。

在病毒清除工藝的選擇與具體設(shè)計(jì)方面，我們需遵循一系列嚴(yán)格的原則和要求。首先，選擇工藝時(shí)需確保至少包含一步有效的非包膜病毒清除步驟，這是保障病毒清除效果的基礎(chǔ)。同時(shí)，工藝中還需至少包含兩種從機(jī)制上能互補(bǔ)且有效的工藝步驟，以增強(qiáng)病毒清除的全面性和可靠性。

在具體設(shè)計(jì)工藝方案時(shí)，我們需進(jìn)一步細(xì)化各項(xiàng)要求。首先，雙申報(bào)去除/滅活病毒的驗(yàn)證研究必須符合GLP（Good Laboratory Practice，良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范）的要求，以確保研究的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。其次，我們需要研究影響去除/滅活病毒效果的各項(xiàng)參數(shù)，包括機(jī)械參數(shù)和理化參數(shù)，并確定這些參數(shù)允許變化的幅度，通常通過驗(yàn)證最劣條件來確保工藝的穩(wěn)定性和適應(yīng)性。

此外，病毒滅活動(dòng)力學(xué)的研究也是不可或缺的，這包括病毒滅活速率和滅活曲線的分析，有助于我們更深入地了解病毒滅活的動(dòng)態(tài)過程。同時(shí)，為了更準(zhǔn)確地評(píng)估病毒清除效果，指示病毒的滴度應(yīng)盡可能高，以模擬最壞情況下的病毒負(fù)載。最后，在加入病毒進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，病毒與待驗(yàn)證樣品的體積比需控制在一定范圍內(nèi)，一般不超過1∶9，以避免因病毒濃度過高或過低而影響驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，通過遵循這些原則和要求，我們可以設(shè)計(jì)出更加科學(xué)、有效且可靠的病毒清除工藝。常用的病毒滅活/去除工藝如Table 5所示。

Table 5. 病毒滅活/去除工藝

巴氏消毒法是在60℃條件下對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行連續(xù)加熱至少10h，其原理是長(zhǎng)時(shí)間高溫使病毒蛋白變性從而抑制病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制，最終使病毒失去傳染性。巴氏滅菌法對(duì)包膜病毒和非包膜病毒均有效果，是白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑等血液制品常用的病毒滅活方法。

采用80℃加熱72h的處理方法可以滅活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。應(yīng)該考慮制品的水分含量、制品組成（如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸）對(duì)病毒滅活效果的影響，應(yīng)確定允許的制品瓶間各參數(shù)的差異，同時(shí)病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗(yàn)證一次。干熱法適用于凍干制劑、凝血因子制品。

利用有機(jī)溶劑和非離子表面活性劑的混合物能夠破壞脂包膜病毒的類脂膜。通常選擇磷酸三丁脂 (TNBP) 和非離子化的去污劑（Triton X-100或PS80）組合。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制劑、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒滅活。因?yàn)镾/D法引入有機(jī)溶劑，所以需要在后續(xù)工藝中去除加入的S/D試劑。

如Fig.2所示，使用mAb1和mAb2收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估溫度和Triton X-100濃度對(duì)MuLV滅活的影響。對(duì)于這兩種單抗，在12℃時(shí)的滅活速度比20℃慢，這表明較低的溫度和較短的時(shí)間是最差的情況，A和B圖對(duì)比表明0.3%和0.5%Triton X-100對(duì)MuLV的滅活效果無差異。

Fig.2 Genentech研究溫度(A)、時(shí)間(B) 和Triton X-100濃度對(duì)X-MuLV滅活的影響

低pH滅活法針對(duì)包膜病毒而且要求樣品在低pH條件下性質(zhì)穩(wěn)定。低pH滅活法是重組或者雜交的動(dòng)物真核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后表達(dá)、分泌的生物制品和直接采用動(dòng)物組織原材料經(jīng)提取、純化制備的治療用生物制品常用滅活方法。從病毒滅活效果的角度看：pH越低、孵育溫度越高、孵育時(shí)間越長(zhǎng)或者樣品濃度越低，則滅活效果越好。

納濾膜過濾法是當(dāng)前最可靠的病毒清除技術(shù)，主要基于尺寸排阻，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔徑的蛋白通過濾膜，大于平均孔徑的病毒截留在膜內(nèi)，對(duì)各類病毒（包膜病毒和非包膜病毒）達(dá)到有效清除。使用20nm左右的濾膜對(duì)生物制品溶液進(jìn)行過濾，去除指數(shù)通�？梢赃_(dá)到4LRV以上，且不影響產(chǎn)品質(zhì)量，有效且穩(wěn)健。

利用病毒和目標(biāo)產(chǎn)品在與層析介質(zhì)接觸時(shí)親和力或其他相互作用方面的差別，實(shí)現(xiàn)各種組分的分離。層析方法包括親和層析、陰或陽離子交換、復(fù)合模式層析等，Table 6列舉了這幾種層析方法去除病毒的能力。

層析技術(shù)去除病毒，需要考慮層析技術(shù)類型和層析填料使用次數(shù)（新、舊填料）對(duì)于去除病毒效果的差別，一般情況下，新舊填料的病毒清除能力沒有顯著差異。

Table 6. 層析技術(shù)病毒清除結(jié)果

藥品申報(bào)新藥研究申請(qǐng) (Investigational New Drug, IND) 階段的要求主要體現(xiàn)在模型病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復(fù)性3個(gè)方面。Table 7列舉了國(guó)內(nèi)外血液制品和抗體/重組蛋白制品在IND申報(bào)階段的要求。

Table 7. 國(guó)內(nèi)外IND申報(bào)病毒滅活/去除驗(yàn)證要求

注：血制品中模型病毒選擇時(shí)，水皰性口炎病毒（VSV）耐受的pH范圍比較廣，驗(yàn)證低pH孵育法滅活病毒效果時(shí)可選用此指示病毒。

藥品申報(bào)生物制品許可申請(qǐng) (Biologics License Application, BLA) 階段的要求主要體現(xiàn)在指示病毒的選擇、工藝選擇和工藝重復(fù)性3個(gè)方面，同時(shí)要求更加嚴(yán)格。Table 8列舉國(guó)內(nèi)外血液制品和抗體/重組蛋白制品在BLA申報(bào)階段的要求。

Table 8. 國(guó)內(nèi)外BLA申報(bào)病毒滅活/去除驗(yàn)證要求

由于在生產(chǎn)規(guī)模上進(jìn)行病毒清除驗(yàn)證研究是不現(xiàn)實(shí)的，驗(yàn)證只能按照生產(chǎn)工藝的縮小規(guī)模進(jìn)行�？s小模型在關(guān)鍵參數(shù)及控制條件方面應(yīng)與實(shí)際生產(chǎn)工藝嚴(yán)格保持一致。對(duì)于層析工藝，親和層析和陰離子層析表現(xiàn)出有效的病毒清除能力，因此這兩個(gè)層析步驟也常用于病毒清除驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。Table 9列舉了親和層析和陰離子層析（流穿模式）除病毒驗(yàn)證中的最差工藝條件。

Table 9. 工藝參數(shù)要求

在評(píng)估病毒清除效果時(shí)，細(xì)胞毒性和病毒干擾性是兩個(gè)必須考慮的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼈儠?huì)嚴(yán)重干擾病毒滴度的準(zhǔn)確測(cè)定。因此，在工藝中間品中加入病毒以研究其清除效果之前，首要任務(wù)是對(duì)這些中間品進(jìn)行深入的細(xì)胞毒性和病毒干擾性研究，以確保準(zhǔn)確評(píng)估樣品中的實(shí)際病毒滴度。此外，在病毒滅活/去除的工藝驗(yàn)證環(huán)節(jié)中，對(duì)病毒檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性均提出了高要求。
在病毒滅活/去除的工藝驗(yàn)證中，病毒的檢測(cè)方法要求高靈敏度、高特異性以及很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。目前的病毒檢測(cè)方法主要為噬斑檢測(cè)法（定量）、細(xì)胞病變法（半定量）、核酸定量（定量檢測(cè)）。

• 噬斑檢測(cè)法(PFU 法)：適用于去除和滅活工藝。 

• 細(xì)胞病變(TCID50 法)：適用于去除和滅活工藝。 

• 核酸定量(qPCR 法)：適用于去除工藝；不適用于滅活工藝。

對(duì)于起始數(shù)目可以估算的病毒，如模型逆轉(zhuǎn)錄病毒，F(xiàn)ig.3提供了如何計(jì)算安全系數(shù)的例子。這種計(jì)算的基本目的是找出單個(gè)病毒顆粒進(jìn)入單劑量產(chǎn)品的概率，下游病毒滅活/去除工藝4~6個(gè)對(duì)數(shù)的過量清除基本上意味著10^4~10^6個(gè)劑量中只有一個(gè)劑量可以含有病毒顆粒。

Fig.3 計(jì)算模型逆轉(zhuǎn)錄病毒的安全系數(shù)的例子

為了有效控制生物制品的病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)，我們必須高度重視起始原材料的污染風(fēng)險(xiǎn)及其檢測(cè)，同時(shí)密切關(guān)注生產(chǎn)工藝過程中病毒的清除能力。依據(jù)相關(guān)法規(guī)，我們應(yīng)制定科學(xué)合理的病毒滅活/去除驗(yàn)證工藝以及檢測(cè)方法，以便準(zhǔn)確評(píng)估工藝的有效性。此外，在生物制品的整個(gè)生命周期內(nèi)，我們都需要持續(xù)進(jìn)行病毒污染風(fēng)險(xiǎn)的控制與檢測(cè)，從而最大限度地降低生物制品的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，確保產(chǎn)品的安全性。

 

[1] NMPA：生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)的技術(shù)審評(píng)一般原則，2005.12

[2] NMPA：血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則，2002.05

[3] ICH. Q5A: Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1999

[4]《中國(guó)藥典》三部2020年版：生物制品通則-生物制品病毒安全性控制

[5] Technical Report No. 83. Virus Contamination in Biomanufacturing: Risk Mitigation, Preparedness, and Response. PDA. 2019

[6] FDA：Guidance for Industry -Process Validation: General Principles and Practices. 2011

[7] Cytiva學(xué)堂：生物制品病毒滅活/去除驗(yàn)證研究

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì)：治療用生物制品病毒污染風(fēng)險(xiǎn)控制要點(diǎn)，2021

[9] George Miesegaes.(2014)Viral Clearance by Traditional Operations With Significant Knowledge Gaps (Session II): Cation Exchange Chromatography (CEX) and Detergent Inactivation. PDA 

[10] Shukla, A. Aranha, H. (2015) Viral clearance for biopharmaceutical downstream processes. Pharmaceutical Bioprocessing.