文章作者：red red sea 文章來(lái)源：Super Lab

背景介紹：在蛋白表達(dá)系統(tǒng)的相關(guān)研究中，從頭合成蛋白質(zhì)并不是一個(gè)可行的選擇。因此需要借助活細(xì)胞或細(xì)胞器用作生產(chǎn)和構(gòu)建蛋白質(zhì)的工廠。利用基因重組技術(shù)將特定基因的DNA序列作為模板生成蛋白質(zhì)，被稱為重組蛋白。其原理是將目的基因通過電轉(zhuǎn)化或者熱激等手段轉(zhuǎn)入合適的宿主中，利用宿主的特定生理、生化和遺傳特點(diǎn)進(jìn)行目標(biāo)蛋白大量表達(dá)及純化的生物技術(shù)。廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)研究、生物治療、藥物開發(fā)等。本篇推文將從蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建到如何提高蛋白的表達(dá)效率以及表達(dá)宿主如何選擇來(lái)進(jìn)行介紹，希望給做蛋白表達(dá)的初學(xué)者提供一些幫助！

蛋白質(zhì)的產(chǎn)生
蛋白質(zhì)合成的步驟，遺傳信息儲(chǔ)存于 DNA中，以此為模板經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成信使 RNA，mRNA編碼的信息隨后被翻譯成氨基酸序列形成蛋白質(zhì)(圖1)。真核與原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯有一定區(qū)別。原核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時(shí)發(fā)生的。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA不需要剪切、拼接等，真核生物轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中進(jìn)行，翻譯在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，該過程是存在空間分隔的且有順序發(fā)生，翻譯后通過多種方式對(duì)多肽進(jìn)行修飾，形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
 

圖1. 中心法則

蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
通常來(lái)說，典型的蛋白質(zhì)表達(dá)載體需包括以下主要元件：
• 多克隆位點(diǎn) (MCS) ；• 目的基因表達(dá)框：包括啟動(dòng)子和基因終止或 poly (A) 信號(hào) ；• 細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn) (ori) ；• 宿主的抗生素篩選標(biāo)記：如嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)和殺稻瘟菌素（blasticidin) ；• 大腸桿菌的抗生素篩選標(biāo)記：如氨芐青霉素（Ampr）、氯霉素（Camr）、卡那霉素（Kanr等；• 表位標(biāo)簽等 。

表1. 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中常用的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

蛋白標(biāo)簽是重組蛋白制備過程中與目的蛋白融合表達(dá)的蛋白或多肽，標(biāo)簽蛋白的作用一般有：促進(jìn)目的蛋白的可溶性和穩(wěn)定性；便于目的蛋白被檢測(cè)；便于目的蛋白純化。隨著研究的需求和技術(shù)的發(fā)展，各種標(biāo)簽應(yīng)運(yùn)而生，多樣化的標(biāo)簽可以滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br />
表2. 常見的蛋白檢測(cè)標(biāo)簽

表3. 蛋白純化標(biāo)簽及應(yīng)用

提高蛋白表達(dá)的策略
密碼子優(yōu)化：選擇最合適的表達(dá)載體，構(gòu)建時(shí)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使蛋白質(zhì)在宿主內(nèi)表達(dá)更完全；提高蛋白溶解度：①調(diào)節(jié)表達(dá)條件參數(shù)：優(yōu)化培養(yǎng)基的濃度、pH值、類型甚至是批次或批號(hào)，還可向培養(yǎng)基中添加特定的試劑，例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑來(lái)提升蛋白表達(dá)水平；②融合蛋白標(biāo)簽：低產(chǎn)量提高蛋白表達(dá)的策略可使用分子融合伴侶技術(shù)。該策略利用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、標(biāo)簽和其它融合元件來(lái)提高蛋白的溶解度。蛋白標(biāo)簽是插入到重組蛋白上的短肽序列，通常會(huì)在蛋白表達(dá)結(jié)束時(shí)采用酶切或化學(xué)試劑去除，比如His,Flag,GST；Fc等。③溫度：對(duì)于HEK293和其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，在37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。有研究表明，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將溫度從37°C降至33°C培養(yǎng)，可提高HEK293細(xì)胞的蛋白表達(dá)。

如何選擇蛋白表達(dá)系統(tǒng)
目前，較為主流的表達(dá)宿主有大腸桿菌（E.coli）、畢赤酵母（P.pastoris）、昆蟲-桿狀病毒（Bac-to-Bac系統(tǒng)）以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（CHO、HEK293）等。

總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)，使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成本相對(duì)較低，并且能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)產(chǎn)物，但目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，產(chǎn)物純化困難，且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，成本低，但翻譯后加工修飾體系與哺乳動(dòng)物不完全相同。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然狀態(tài)，但表達(dá)量低，操作繁瑣。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)充分考慮各種因素，如要表達(dá)蛋白的性質(zhì)、生產(chǎn)成本、表達(dá)水平、安全性、表達(dá)周期等。