原創(chuàng):孔維國(guó)等 文章來源：中華結(jié)核和呼吸雜志

作者：孔維國(guó) 林欣 朱俊豪 林澤強(qiáng) 朱思源 張子麗 盧文菊

單位：廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家呼吸醫(yī)學(xué)中心 廣州呼吸健康研究院；廣州醫(yī)科大學(xué)

引用本文: 孔維國(guó), 林欣, 朱俊豪, 等. 肺泡類器官在常見肺疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2023, 46(8): 829-834. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20230501-00207.

摘要

類器官是將組織細(xì)胞通過3D培養(yǎng)形成的一種能高度模擬體內(nèi)生理病理狀態(tài)的組織培養(yǎng)物，有助于研究體內(nèi)組織器官發(fā)生發(fā)育過程中細(xì)胞時(shí)間和空間維度的變化，探究各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致細(xì)胞功能及通訊的改變，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)。本文綜述肺泡類器官的培養(yǎng)、鑒定方法，及在肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病及病毒性肺炎等常見呼吸疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展，分析討論肺泡類器官使用的局限性和未來主要的應(yīng)用方向。

類器官技術(shù)是一種新型三維（three-dimensions，3D）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）或成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASC）進(jìn)行分裂與分化，形成與其來源的特定組織或器官相似的體外模型，該體外模型即為類器官。近年來類器官技術(shù)呈飛躍式發(fā)展趨勢(shì)，目前已經(jīng)成功建立肺、氣道、腸道、胃、腎臟、大腦等類器官模型［ 1 ］，類器官不僅能高度模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，保持細(xì)胞生長(zhǎng)的空間結(jié)構(gòu)，而且能更好地代表來源組織器官的生理功能和生物學(xué)特性［ 2 ］，有助于深入研究各種分子和信號(hào)通路對(duì)器官形成過程在不同時(shí)期的作用［ 3 ］。

在多種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著肺泡結(jié)構(gòu)不同程度的病變，如慢性阻塞性肺疾�。ê�(jiǎn)稱慢阻肺）、特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以及近年來波及全球的新型冠狀病毒感染性肺炎（簡(jiǎn)稱新冠肺炎）等。傳統(tǒng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蛞欢ǔ潭壬线�原人體肺泡結(jié)構(gòu)的變化情況，但生物學(xué)特性仍有許多不同，利用新型模型模擬人體肺泡層面更為真實(shí)的變化情況迫在眉睫。肺泡類器官是指肺干細(xì)胞3D支持培養(yǎng)下形成的類似于肺泡細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)物，該類器官表達(dá)肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物且包含部分肺間充質(zhì)細(xì)胞。目前針對(duì)肺泡類器官的不同處理已在多種涉及肺泡病變的肺部疾病有了廣泛研究進(jìn)展［ 4 , 5 , 6 ］。

一、肺泡類器官培養(yǎng)體系

肺泡類器官的培養(yǎng)基于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type Ⅱ alveolar cells，ATⅡ）所具有的多能干細(xì)胞特性。ATⅡ主要通過流式細(xì)胞分選技術(shù)（flow cytometry sorting，F(xiàn)CS）［ 7 , 8 ］和磁珠分選法獲取。除了ATⅡ本身之外，肺泡類器官的培養(yǎng)體系還需要添加其他共培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞因子。最初使用的有PDGFRα+成纖維細(xì)胞［ 7 , 8 , 9 , 10 ］等�，F(xiàn)多在類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加有利于ATⅡ增殖及分化的細(xì)胞因子，最常使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12，添加的細(xì)胞因子主要有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）2和10、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、Noggin、R-spondin-1、Y-27632、CHIR 99021、SB 431542等［ 11 , 12 ］，具體添加的種類以及用量需要根據(jù)培養(yǎng)目的進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。肺泡類器官3D結(jié)構(gòu)的形成需要一定的支撐體系，目前使用最為廣泛的為基質(zhì)膠［ 13 ］。除基質(zhì)膠以外，近期有文獻(xiàn)報(bào)道了一種使用透明質(zhì)酸水凝膠培養(yǎng)肺泡類器官的方法，該方式能夠有效減少肺泡類器官大小及結(jié)構(gòu)的不均一性［ 14 ］，未來有潛力成為基質(zhì)膠的替代品。目前肺泡類器官的培養(yǎng)體系仍在不斷更新迭代，對(duì)不同細(xì)胞因子和支撐物等研究越來越多，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷革新，肺泡類器官作為一種理想的新型模型在肺部疾病的探索征途上扮演著越來越重要的角色（ 圖1 ）。

二、肺泡類器官的優(yōu)越性

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方案主要通過體外培養(yǎng)各種肺部細(xì)胞并給予一定條件刺激、構(gòu)建動(dòng)物疾病模型等模擬人體各種肺部疾病開展研究，然而體外細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)環(huán)境仍有較大區(qū)別，相對(duì)于組織及器官層面細(xì)胞培養(yǎng)不能很好地反映體內(nèi)多因素對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的潛在影響。動(dòng)物模型能夠在部分程度上還原疾病在人體內(nèi)的表現(xiàn)和作用機(jī)制，然而不同種類的動(dòng)物在肺部結(jié)構(gòu)上與人體存在部分差異，如人體氣道遠(yuǎn)端分支于肺泡氣體交換生態(tài)位交織形成呼吸道細(xì)支氣管，小鼠中卻缺乏這種結(jié)構(gòu)［ 15 ］。利用類器官構(gòu)建肺部疾病模型在一定層面上克服了傳統(tǒng)體內(nèi)外模型的不足之處，其培養(yǎng)來源細(xì)胞可通過多種途徑從人體分離獲得，在短期內(nèi)即可培養(yǎng)出大量類器官結(jié)構(gòu)［ 16 ］。類器官適用于研究多種肺部細(xì)胞間的相互作用，從整體的層面反映疾病因素所導(dǎo)致的多種細(xì)胞機(jī)制變化［ 17 ］。肺泡類器官在正常生理中有助于探索人體內(nèi)肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生發(fā)育過程中肺泡細(xì)胞時(shí)間維度的變化，如何實(shí)現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)的重建是肺再生的研究重點(diǎn)之一；在病理層面探究各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致肺泡細(xì)胞功能及通訊的改變有助于發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)。因此，肺泡類器官作為新型工具在涉及肺泡病變的疾病研究中存在廣泛的優(yōu)越性（ 表1 ）。

三、肺泡類器官在常見肺疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

1. 肺纖維化：肺纖維化是一種慢性的、進(jìn)行性發(fā)展且預(yù)后不佳的致死性間質(zhì)性肺疾病，其中最嚴(yán)重以及最常見的一種為特發(fā)性肺纖維化。IPF的發(fā)病機(jī)制基于最初的肺泡上皮損傷，隨后表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度積累，進(jìn)而破壞了肺的正常生理結(jié)構(gòu)以及功能［ 18 , 19 ］。運(yùn)用類器官技術(shù)在IPF的相關(guān)研究近年來不斷增加（ 表2 ）。

最初的類器官IPF模型主要包含肺泡上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞以及各種肺部其他細(xì)胞。Wilkinson等［ 20 ］首次利用包含肺泡上皮細(xì)胞的肺類器官建立體外IPF模型。在功能化的藻酸鹽珠周圍搭建包括間充質(zhì)細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)建人iPSC（human iPSC，hPSC）來源的肺類器官，用TGF-β處理之后發(fā)現(xiàn)能夠生成高水平Ⅰ型膠原以及a-SMA的局部斑塊，類似于IPF患者中的成纖維細(xì)胞病灶。與此不同的是，Surolia等［ 21 ］通過手術(shù)活檢獲得正常人和IPF患者的部分肺組織后提取細(xì)胞懸液制備成肺球樣類器官，包含了ATⅡ（SFTPC+）、肌成纖維細(xì)胞（a-SMA）等細(xì)胞，在來源于IPF患者的類器官觀察到明顯的侵襲性肌成纖維細(xì)胞區(qū)域，與正常組相比細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)具有差異性，這種構(gòu)建方法更利于針對(duì)不同患者進(jìn)行個(gè)性化治療方案的設(shè)計(jì)。Hermansky-Pudlak綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome，HPS）是一種常染色體隱性疾病，絕大多數(shù)患者表現(xiàn)出類似于IPF的臨床病變，Strikoudis等［ 22 ］將包含大量ATⅡ以及少量間充質(zhì)的hPSC運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)使多個(gè)HPS基因發(fā)生移碼突變后進(jìn)行特定培養(yǎng)，產(chǎn)生了具備纖維化表型的類器官，從而提供了一個(gè)新的研究模型以更好地確定IPF的發(fā)病機(jī)制。Suezawa等［ 23 ］采用FCS將hPSC分選出SFTPC+細(xì)胞后，對(duì)衍生的肺泡類器官給予BLM刺激，在該模型中觀察到ATⅡ、ATⅡ-ATⅠ中間狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生衰老、成纖維細(xì)胞激活、類器官整體收縮和細(xì)胞外基質(zhì)的積累，類似于IPF中的纖維生成。肺泡類器官IPF模型的構(gòu)建目前通過給予致纖維化因子或藥物，以及特定基因突變誘導(dǎo)產(chǎn)生類似于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋硇停瑸镮PF的研究擴(kuò)展出一條新的道路，然而多種處理方式所產(chǎn)生的類器官病變?nèi)源嬖诓糠植町�，且涉及機(jī)制具有不同之處，因此圍繞研究?jī)?nèi)容選擇合適的處理方式尤為重要。2. 慢阻肺：慢阻肺是一種可預(yù)防可治療，以持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限為特征的常見疾病［ 24 ］。在中國(guó)，目前接近有1億人患有不同程度的慢阻肺，因其死亡的人數(shù)在單病種致死排序中排到了第三位［ 25 ］。隨著病情進(jìn)展，慢阻肺患者肺泡上皮細(xì)胞修復(fù)功能的進(jìn)行性障礙促進(jìn)了肺氣腫的發(fā)生和發(fā)展，因此尋找合適的肺再生方法尤為重要。其中，運(yùn)用類器官模擬慢阻肺模型研究肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機(jī)制近年來被廣泛認(rèn)可并采納（ 表2 ）。由于吸煙是促進(jìn)慢阻肺發(fā)生發(fā)展最主要的危險(xiǎn)因素，因此常給予香煙煙霧（cigarette smoke，CS）以及香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激分別構(gòu)建疾病的體內(nèi)體外模型。在一項(xiàng)將小鼠長(zhǎng)期暴露于CS模擬慢阻肺的研究中，使用離體肺泡類器官模型來探索一種被稱為“序列相似成員13A家族”（family with sequence similarity 13 member A，F(xiàn)AM13A）的基因的作用，肺泡類器官由熏煙處理的FAM13A+/+和FAM13A-/-小鼠產(chǎn)生。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM13A的缺失與ATⅡ的增殖分化以及肺泡類器官生長(zhǎng)趨勢(shì)增加有關(guān)，暴露于CS中時(shí)，F(xiàn)AM13A缺失會(huì)上調(diào)ATⅡ中WNT的激活，并且相比FAM13A+/+小鼠發(fā)育出更多的肺泡類器官［ 26 ］。另一項(xiàng)研究中，通過體外3D培養(yǎng)原代小鼠ATⅡ構(gòu)建肺泡類器官，給予不同濃度的CSE刺激一定時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)達(dá)到CSE毒性濃度之前，增加CSE濃度能夠激活A(yù)TⅡ細(xì)胞的干細(xì)胞功能，包括誘導(dǎo)其更快速的增殖和分化，增強(qiáng)對(duì)凋亡的抵抗力，形成體積更大、數(shù)量更多的肺泡類器官［ 27 ］。空氣污染也是促使慢阻肺進(jìn)展的重要因素，Yu等［ 28 ］將PM2.5加入在肺泡類器官的生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及分化培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)PM2.5處理后引起了肺泡類器官的損傷，ATⅡ的增殖水平升高但修復(fù)功能受損，ATⅠ與ATⅡ的比值明顯下降，表明抑制了ATⅡ細(xì)胞進(jìn)入轉(zhuǎn)分化的過程。Wu等［ 29 ］使用不同濃度柴油廢氣顆粒（diesel exhaust particles，DEP）連續(xù)處理小鼠以及人肺泡類器官14 d后，發(fā)現(xiàn)類器官的體積及數(shù)量均顯著減少，且與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下調(diào)有關(guān)。由于慢阻肺致病因素的復(fù)雜性，體內(nèi)外有多種造模方式，然而具有局限性。給予肺泡類器官各種有害顆粒提取物處理后得到的結(jié)果與大多數(shù)體內(nèi)外疾病模型具有一致性，且能更直觀地展現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞的慢性演變，因此有望被廣泛應(yīng)用于慢阻肺發(fā)病過程及肺再生的機(jī)制研究。3. 新冠病毒感染及肺炎：新冠病毒肺炎是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型引起的呼吸道感染性疾病，至今仍在全球范圍內(nèi)不斷蔓延［ 30 ］。截至2023年1月22日，全球報(bào)告確診病例超過6.64億例，死亡病例超過670萬例［ 31 ］。部分患者感染新冠病毒后會(huì)引起彌漫性的肺泡損傷，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［ 32 ］，為了解其具體的發(fā)病機(jī)制，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者們利用肺泡類器官創(chuàng)建了多種體外病毒感染模型以深入研究（ 表2 ）。最初開發(fā)的類器官模型用于藥物篩選。Han等［ 33 ］將hPSCs培養(yǎng)成包含ATⅡ的肺類器官后，利用其表達(dá)ACE2的特性使培養(yǎng)物感染新冠病毒后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)多種趨化因子和細(xì)胞因子有較高的表達(dá)水平，且?guī)缀鯖]有I/Ⅲ型干擾素（interferon，IFN）信號(hào)的表達(dá)，這與新冠病毒肺部感染的患者觀察到的情況類似，使用伊馬替尼和霉酚酸能夠減緩病毒對(duì)類器官的感染。同年7月，Salahudeen等［ 34 ］采用去除ECM懸浮培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)出外層為肺泡上皮細(xì)胞的類器官球體，免疫熒光結(jié)果顯示ACE2定位于類器官外表面的細(xì)胞膜，用新冠病毒感染后發(fā)現(xiàn)肺泡類器官中約10%的SPTPC+細(xì)胞有明顯的新冠病毒核衣殼蛋白表達(dá)，證明ATⅡ能夠直接被病毒所感染。Katsura等［ 35 ］確定了成人肺泡干細(xì)胞長(zhǎng)期擴(kuò)張和分化的條件后，構(gòu)建了可被新冠病毒直接感染的肺泡類器官，發(fā)現(xiàn)感染后的類器官與新冠病毒感染后的肺部特征相似，如IFN介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)出現(xiàn)、表面活性蛋白的缺失和細(xì)胞凋亡，此外用低劑量IFN預(yù)處理肺泡類器官觀察到病毒復(fù)制的減少，表明其對(duì)新冠病毒的預(yù)防作用。Pei等［ 36 ］也證明了新冠病毒可以感染肺泡類器官中一類特定亞群的ATⅡ，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示在病毒感染后脂質(zhì)代謝過程下調(diào)，此外還發(fā)現(xiàn)瑞德西韋可有效抑制新冠病毒在類器官中的復(fù)制。上述多項(xiàng)研究已共同證明新冠病毒感染肺泡類器官的體外模型已成功構(gòu)建，在已有的動(dòng)物、細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，為后續(xù)肺泡上皮病變機(jī)制研究、抗病毒藥物篩選提供了一種新型且有效的工具。未來可聚焦于病毒感染肺泡類器官后結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合分析，探索不同毒株所引起肺泡病變所具有的差異性。

四、展望

類器官技術(shù)的出現(xiàn)有效地填補(bǔ)了體外模擬人類器官在疾病狀態(tài)變化方面的空白。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，在多種涉及肺泡病變的肺部疾病中，包括IPF、慢阻肺以及新冠病毒引起的肺部感染，研究人員可通過直接分離患者或疾病模型體內(nèi)的肺泡干細(xì)胞后培養(yǎng)成類器官，輔以CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建合適的疾病模型；也可對(duì)正常狀態(tài)的肺泡類器官給予致病因子、藥物或病毒進(jìn)行刺激，以模擬這些致病因素對(duì)肺泡類器官結(jié)構(gòu)和功能的影響。目前應(yīng)用肺泡類器官為疾病在肺泡結(jié)構(gòu)層面所產(chǎn)生的病理生理變化、發(fā)病機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路提供了新的研究方法，有助于針對(duì)各疾病的相應(yīng)靶點(diǎn)篩選有效藥物從而進(jìn)一步推進(jìn)臨床試驗(yàn)研究。不只于肺泡類器官，隨著各種類器官的培養(yǎng)條件不斷成熟化、標(biāo)準(zhǔn)化，這種新型體外培養(yǎng)模型將被越來越多的研究人員所掌握并運(yùn)用在基礎(chǔ)研究中；在臨床診療中，未來針對(duì)不同的患者提取病變部位具有干細(xì)胞活性的成體細(xì)胞，培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的類器官結(jié)構(gòu)后制定個(gè)性化治療方案，有望成為更安全、更有效的一種策略。