細胞鋪板是細胞實驗的第一步，將細胞鋪得均勻、密度適宜是對于確保實驗結(jié)果的準確性、可重復性和可信服性具有不可替代的作用。接下來隨小 M 一起看看細胞鋪板有哪些秘密訣竅呢~

細胞鋪板是細胞生物實驗起始的重要步驟，可以說是引領著一個細胞實驗成敗的關鍵！其基本原理是將一定數(shù)量的細胞均勻，密度合適的接種到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，以便后續(xù)進行一系列細胞實驗。
 

圖 1. 實驗流程和操作步驟。 
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無論是藥物篩選、基因表達研究還是細胞信號通路分析，細胞鋪板都是實驗設計中的關鍵步驟。正確的細胞鋪板可以確保細胞的健康生長和實驗的可重復性，從而獲得可靠的實驗數(shù)據(jù)。
 
01
細胞鋪板實驗

一、準備工作

1. 實驗材料：細胞培養(yǎng)皿，細胞計數(shù)儀，完全培養(yǎng)基，PBS，胰酶，移液槍及槍頭等。
小貼士：完全培養(yǎng)基一般是由無血清培養(yǎng)基+胎牛血清 (FBS) +青霉素/鏈霉素雙抗組成。

2. 無菌環(huán)境：實驗開始前對實驗材料進行清潔并無菌處理，如紫外照射。

3. 培養(yǎng)基預熱：將完全培養(yǎng)基，PBS，胰酶，置于 37℃ 預熱至室溫，減少細胞冷應激。

二、收集細胞

1. 選擇細胞：根據(jù)實驗需求選擇生長速度、形態(tài)、特性等合適的細胞系或提取原代細胞。

2. 觀察細胞狀態(tài)：將細胞放置在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)及密度。以貼壁細胞為例，若培養(yǎng)基澄清透明且無漂浮雜質(zhì)，當細胞生長至 80-90% 密度且狀態(tài)良好時，則可以進行細胞傳代或鋪板。

3. 細胞消化：將細胞進行傳代，棄去培養(yǎng)基，取適量的 PBS 輕輕潤洗 2-3 次，吸盡上清。加入適量的胰酶置于 37℃ 培養(yǎng)箱中消化 (消化時間根據(jù)細胞類型而定)，待細胞皺縮且間隙變大、可從皿底滑落且不聚團成塊時即可加培養(yǎng)基終止消化。
小貼士：應隨時觀察細胞消化狀態(tài)，消化時間太短或太長都會影響細胞狀態(tài)哦~

三、細胞計數(shù)

將終止消化的細胞輕輕吹打，使細胞完全從皿底脫落。將細胞懸液收集至離心管中，以 800-1000 rpm，3 min 進行離心，棄上清。加入適量的完全培養(yǎng)基充分重懸細胞團塊，輕輕吹打混勻后取 10 μL 細胞懸液與 10 μL 臺盼藍輕輕混勻，用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，再根據(jù)實驗鋪板密度的需要計算所需細胞懸液的體積。

四、細胞鋪板

▐ 確定鋪板密度
1. 不同孔板鋪細胞數(shù) (以 HEK 293 細胞為例) 鋪板密度

  
小貼士： 細胞密度太大容易造成細胞活性差和細胞死亡，細胞密度太小會造成細胞生長緩慢，產(chǎn)物表達降低和污染風險增加。

圖 3. HT-1080 細胞鋪板 1 h 內(nèi)拍照。 
密度太大（左）和密度太小（右）

2. 不同直徑的細胞系鋪板密度

表 2. 不同直徑的細胞鋪板密度需求^[1]。

  小貼士：

• 接種密度：小細胞可以在相對較高的密度下生長，而大細胞需要較低的密度以避免接觸抑制。

• 細胞形態(tài)：大細胞通常需要更多空間來擴展和生長。

• 時間和方法：大細胞細胞生長較慢，需要更長的時間來生長到可傳代的狀態(tài)。在處理和傳代時，大細胞需要更溫和以減少對細胞的損傷。

 
3. 實驗類型

表 3. 不同實驗類型的細胞鋪板密度需求。 

▐ 鋪板操作

確定鋪板密度后，根據(jù)自己所需的細胞量即可計算所需的細胞懸液體積。

舉個栗子：若需要 5 mL 密度為 10⁵/mL 的細胞量，細胞計數(shù)結(jié)果為 2×10⁶/mL，則吸取 250 μL 的細胞懸液與 4.75 mL 的完全培養(yǎng)基混合即可。

用移液槍吸取適量的細胞懸液 (避免吸取氣泡)，在培養(yǎng)皿上方豎直懸空均勻、緩慢地滴加在各個角落。蓋上培養(yǎng)皿后沿著水平桌面采用“8”字法或者“十字”形輕輕搖晃培養(yǎng)皿，重復 5-6 次確保使細胞均勻分布在培養(yǎng)皿中，然后進行鋪板操作^[10]。

小貼士：如何鋪的均勻？
答：“8” 字法 or 十字混勻法。

1. 96 孔板：

充分混勻細胞懸液后 (避免產(chǎn)生氣泡)，用排槍吸取計數(shù)后一定體積的細胞，槍頭與孔壁呈 45 ℃ 沿壁緩慢并均勻地將細胞懸液分配到每個孔中。若加樣孔太多，建議每鋪一部分及時混勻細胞懸液。在接種完成之后，蓋上 96 孔板，靜止 3-5 min。
 

2. 其他孔板或者培養(yǎng)皿：

• 8 字法：以 24 孔板為例，細胞鋪完后，貼著水平桌面畫 “8” 字軌跡，重復 5-6 次。
• 十字混勻法：以 24 孔板為例，細胞鋪完后，貼著水平桌面先上下移動，再左右移動，呈十字形狀，重復 5-6 次。

小貼士：

• 搖晃過程中應注意力度，防止培養(yǎng)基濺灑出來污染細胞哦~
• 細胞易沉降，建議每鋪一部分孔 (比如半塊板)，及時混勻預先配制的細胞懸液，然后繼續(xù)鋪板。

▐ 后續(xù)觀察

鋪完細胞后記得顯微鏡下觀察確認細胞的均勻度和密度，如果你能觀察到細胞“顆粒”分明、分布均勻且密度中等，那么恭喜你，細胞鋪板工作你已經(jīng)完美結(jié)束啦~趕緊將你的細胞放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)啦！

圖 5. 成功鋪板后的 HT-1080 細胞 0 h（左）和 2 h（右）。 

最后！��！千萬不要鋪完細胞就撒手不管啦~細胞也是有生命的，需要被時時“關愛”與“呵護”的哦~

• 定期使用顯微鏡觀察細胞形態(tài)、增殖情況。
• 記錄細胞生長曲線，評估實驗效果。
• 根據(jù)實驗目的，適時進行細胞處理 (如藥物添加、轉(zhuǎn)染等)，并繼續(xù)觀察細胞。

02
常見問題及可能原因

一、鋪完細胞后狀態(tài)不佳

可能性原因：

1. 細胞的消化時間過長導致細胞損傷，會影響細胞的生長和代謝功能；
2. 細胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)細菌、真菌或霉菌等污染(如果細胞被支原體感染，可嘗試用支原體清除劑處理)；
3. 細胞密度過大或過小，影響細胞生長狀態(tài)；
4. 細胞吹打用力造成細胞機械損傷，影響細胞正常生命活動；
5. 檢查培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境，確保用來鋪板的細胞傳代次數(shù)不多，細胞活力好。

二、細胞密度不均勻

可能性原因：

1. 細胞的消化時間過短或過長，導致細胞消化不充分或細胞結(jié)團率太高；
2. 細胞本身性質(zhì)，偏向于成團生長，如 HepG2。

3. 計數(shù)和鋪板時，細胞重懸吹打次數(shù)太少，未充分混勻，細胞密度分布不均勻；
4. 在進行液體分配時，技術不一致或操作不當可能導致分配不均；
5. 培養(yǎng)環(huán)境中的 pH、溫度或 CO₂ 濃度等參數(shù)不適合細胞，會影響生長和移動。

三、細胞形態(tài)異�；蛩劳�、凋亡

可能性原因：

1. 細胞密度過大或過小，過度擁擠或稀疏；
2. 培養(yǎng)條件不當對細胞造成損傷，比如溫度、氣體成分和培養(yǎng)基；
3. 培養(yǎng)基組分出現(xiàn)過期或變質(zhì)；
4. 在重懸和鋪板過程中，強烈搖晃或過度機械性操作。

03
小結(jié)

除了以上的秘密小技巧外，細胞鋪板也離不開操作手法上的經(jīng)驗積累。希望能夠幫助到每一位科研工作者順利、圓滿的得到自己想要的實驗結(jié)果哦！

產(chǎn)品推薦

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 適于 Hela、293、Cos-7、PC-12、原代成纖維、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、人臍帶靜脈內(nèi)皮、平滑肌等細胞

DMEM/F-12 (1:1), L-Glutamine, Phenol Red, HEPES (HY-K3002) 適于 MDCK、神經(jīng)膠質(zhì)、成纖維和人內(nèi)皮等細胞

DMEM (Low Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3003) 適于 Hela、293、Cos-7、PC-12、原代成纖維、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、人臍帶靜脈內(nèi)皮、平滑肌等細胞

RPMI 1640 (L-Glutamine, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3004) 適于 HeLa、Jurkat、 MCF-7、PC12、PBMC、星形膠質(zhì)和癌細胞等細胞

Fetal Bovine Serum (Superfine), Uruguay (HY-T1000) 特級胎牛血清

PBS Buffer (1×) (HY-K3005) PBS (1×) 磷酸鹽緩沖液

MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) (HY-K3011) MEM 非必需氨基酸溶液(100X)

L-Glutamine (100×), Sterile (HY-K1046) L-谷氨酰胺 (100×)，一種必需氨基酸

0.25% Trypsin-EDTA (1×), phenol red (HY-K3007) 適于細胞解離、常規(guī)細胞培養(yǎng)傳代及原代組織解離

BM-Cyclin (HY-K1059) 支原體清除試劑

Penicillin-Streptomycin (100×), Sterile (HY-K1006)‍ 青霉/鏈霉素雙抗溶液

參考文獻：
[1] Bäckström A, et al. A Sample Preparation Protocol for High Throughput Immunofluorescence of Suspension Cells on an Adherent Surface. J Histochem Cytochem. 2020 Jul;68(7):473-489. 
[2] Hsu SH, et al. The effect of dynamic culture conditions on endothelial cell seeding and retention on small diameter polyurethane vascular grafts. Med Eng Phys. 2005 Apr;27(3):267-72. 
[3] Zhao Y, et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 2014 Sep;6(3):035001. 
[4] Foster KA, et al. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp Cell Res. 1998 Sep 15;243(2):359-66.
[5] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16;65(1-2):55-63.
[6] Wu YK, et al. The Influence of Cell Culture Density on the Cytotoxicity of Adipose-Derived Stem Cells Induced by L-Ascorbic Acid-2-Phosphate. Sci Rep. 2020 Jan 9;10(1):104. 
[7] Heng BC, et al. Effect of cell-seeding density on the proliferation and gene expression profile of human umbilical vein endothelial cells within ex vivo culture. Cytotherapy. 2011 May;13(5):606-17. 
[8] Pijuan J, et al. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.
[9] Nallet-Staub F, et al. Cell density sensing alters TGF-β signaling in a cell-type-specific manner, independent from Hippo pathway activation. Dev Cell. 2015 Mar 9;32(5):640-51.
[10] Dr. Jessica Wagener. Cell seeding protocol-Guide on how to seed cells correctly. Lab Academy. 2021 April 13.