G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是人類基因組中最大的膜蛋白家族，根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)相似性可分為五大類，其中，粘附類GPCRs（aGPCRs）作為GPCRs的第二大類，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和介導(dǎo)許多生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近日，有研究發(fā)現(xiàn)aGPCRs參與了鐵死亡的調(diào)控。
 
鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，由過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化所引起，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤（特別是乳腺癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤）、缺血再灌注損傷、腎損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、心臟病以及多種肝損傷相關(guān)疾病有關(guān)。
 
2024年10月9日，山東大學(xué)初波教授研究團(tuán)隊(duì)，孫金鵬教授團(tuán)隊(duì)，于曉教授團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合東南大學(xué)的柴人杰教授和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院徐云飛教授團(tuán)隊(duì)，在 Cell Metabolism 發(fā)表了題為：Sensing steroid hormone 17a-hydroxypregnenolone by GPR56 enables protection from ferroptosis-induced liver injury 的研究論文。
 
研究揭示了 17-OH PREG-GPR56 軸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)作為一種新的抗鐵死亡途徑，維持肝臟穩(wěn)態(tài)，為肝損傷的潛在治療提供了新的見解，并篩選發(fā)現(xiàn) 17-OH PREG（17α-羥基孕烯醇酮） 可作為GRP56的激動(dòng)劑，能夠抵抗鐵死亡，有效減輕肝損傷。研究還使用了TargetMol的 Sulfosuccinimidyl oleate sodium 以及 CCK-8，讓我們一起跟隨 T 仔來(lái)看看吧~
 
新型鐵死亡抑制因子——GPR56
該團(tuán)隊(duì)首先在 阿霉素（DOX）誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中檢測(cè)了 DOX 處理后 aGPCR 的 mRNA 水平。發(fā)現(xiàn)，三種 aGPCR——GPR56、GPR64 和 GPR97 的 mRNA 水平迅速上升，鐵死亡標(biāo)志物 Ptgs2 的 mRNA 水平顯著升高。其中，GPR56 缺失加劇了 DOX 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡，鐵死亡抑制劑 Ferrostatin-1（Fer-1）的使用能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
  ▲在小鼠肝臟中，aGPCRs 的 mRNA 表達(dá)水平以及不同情況下GPR56表達(dá)情況的蛋白質(zhì)印跡分析
 
進(jìn)一步，通過(guò)在易感鐵死亡的人纖維肉瘤 HT1080 和肝癌 SNU-387 細(xì)胞系中進(jìn)行 aGPCR cDNA 文庫(kù)篩選，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá) GPR56 顯著保護(hù)細(xì)胞免受 Erastin/RSL3 誘導(dǎo)的鐵死亡，而其他 aGPCRs 沒(méi)有表現(xiàn)出類似效果。
 
此外，GPR56 敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 GPR56 作為鐵死亡抑制因子的作用。無(wú)論是敲低 GPR56/補(bǔ)充 GPR56 拮抗劑 Deguelin 均會(huì)使細(xì)胞對(duì)鐵死亡更加敏感。
  (A) 從 CTRP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，GPR56 表達(dá)與 RSL3、ML162 和 ML210 的敏感性相關(guān)。根據(jù) Pearson 相關(guān)系數(shù)繪制基因圖。
(B) 測(cè)量表達(dá)空載體或 aGPCR 載體的 HT1080 細(xì)胞在處理了 1 mM erastin 24 小時(shí)后的細(xì)胞死亡情況（n = 3）。
(C) 表達(dá)空載體或 GPR56 載體的 HT1080 細(xì)胞在處理了不同濃度 RSL3 后的細(xì)胞活力（n = 3）。
(D) 表達(dá) GPR56 sgRNA 的 HT1080 細(xì)胞在處理了不同濃度 RSL3 后的細(xì)胞活力（n = 3）。
 
(E) 表達(dá) GPR56 sgRNA 的 HCCLM3 細(xì)胞在處理了 5 mM RSL3 12 小時(shí)后的細(xì)胞活力（n = 3）。
(F) 從 Gpr56fl/fl 小鼠或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠分離的原代肝細(xì)胞在處理了 500 nM RSL3 16 小時(shí)后的細(xì)胞活力（n = 3）。
(G) HT1080 WT 和 GPR56 KO 細(xì)胞中 GPR56 的免疫印跡分析。
(H) 在處理了 100 nM RSL3 24 小時(shí)后的 HT1080 WT 和 GPR56 KO 細(xì)胞的細(xì)胞活力（n = 3）。
(I) HT1080 WT、GPR56 KO 和轉(zhuǎn)染了 GPR56 載體的 GPR56 KO 細(xì)胞中 GPR56 的免疫印跡分。
(J 和 K) 轉(zhuǎn)染了空載體或 GPR56 載體的 HT1080 WT 和 HT1080 GPR56 KO 細(xì)胞的細(xì)胞死亡（J）和脂質(zhì)過(guò)氧化（K）測(cè)定（n = 3）。

接下來(lái)，研究探討了 GPR56 介導(dǎo)的鐵死亡抑制的分子機(jī)制。

研究者首先檢查了 GPR56 是否影響鐵死亡的經(jīng)典或非經(jīng)典途徑。結(jié)果表明，GPR56 的缺失并未調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)基因的狀態(tài)，且未降低谷胱甘肽（GSH）的水平。此外，GPR56 的缺失對(duì)線粒體活動(dòng)、活性氧（ROS）水平和能量代謝幾乎沒(méi)有影響。
 
由于脂質(zhì)代謝是驅(qū)動(dòng)鐵死亡的關(guān)鍵因素，它們進(jìn)一步進(jìn)行了非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) GPR56 通過(guò)促進(jìn) CD36 的內(nèi)吞 - 溶酶體降解的途徑，從而降低了含有游離多不飽和脂肪酸（PUFA）的磷脂的豐度，從而有效地抑制鐵死亡。

鑒定GPR56激動(dòng)劑——17-OH PREG
為了尋找能夠激活 GPR56 的激動(dòng)劑，研究團(tuán)隊(duì)篩選了一系列類固醇代謝物，最終發(fā)現(xiàn) 17-OH PREG 是唯一能夠激活 GPR56 的類固醇衍生物。
 
17-OH PREG 顯著抑制鐵死亡，并有效消除脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。即使在缺乏 GPX4 或 FSP1 的細(xì)胞中，17-OH PREG 仍表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗鐵死亡作用。
   
(A) GPR56-G 蛋白融合復(fù)合物解離測(cè)定的示意圖。
(B) 熱圖表示 GPR56 在 GPR56-b(DS)-G12、GPR56-b(DS)-G13 或 GPR56-b(DS)-Gq 融合蛋白過(guò)表達(dá)的 HEK293 細(xì)胞中對(duì)類固醇配體刺激的激活反應(yīng)，使用 Stachel 肽（P19）作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò) G 蛋白解離測(cè)定獲得。熱圖顯示 G12 信號(hào)的 EC50（左）、G13 和 Gq 信號(hào)的 Emax（中間和右側(cè)，類固醇配體 100 μM）。熱圖是根據(jù)圖 S4C–S4I 中的數(shù)據(jù)生成的（n = 3）。
(C 和 D) GPR56-b(DS)-G12 (C) 或 GPR56-b(DS)-G13 (D) 融合蛋白對(duì) 17-OH PREG 的濃度依賴性曲線，使用過(guò)表達(dá) pcDNA3.1-G12/13 的 HEK293 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。數(shù)值表示均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）（n = 3）。
(E) 17-OH PREG 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
(F) 配體誘導(dǎo)的 GPR56 活性的熱圖表示。熱圖顯示 EC50（左側(cè)）和 Bmax（右側(cè)）值。數(shù)據(jù)是根據(jù)圖 S4O 中的數(shù)據(jù)生成的。
(G) 在 GPR56-b(DS)-G12 融合蛋白過(guò)表達(dá)的 HEK293 細(xì)胞中，20 μM 17-OH PREG 聯(lián)合刺激下 deguelin 的濃度依賴性曲線。數(shù)值表示均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）（n = 3）。
 
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，17-OH PREG 可顯著減輕急性和慢性肝損傷。在 DOX 誘導(dǎo)的肝損傷模型中，鐵死亡抑制劑 Fer-1 能明顯緩解 DOX 誘導(dǎo)的肝損傷，同時(shí)，給予 17-OH PREG 的小鼠肝臟中，脂質(zhì)過(guò)氧化水平和組織損傷均大幅降低。然而，在肝臟特異性缺失 GPR56 的小鼠中，17-OH PREG 的保護(hù)作用顯著削弱，表明其抗鐵死亡功能與 GPR56 受體密切相關(guān)。在 IR 誘導(dǎo)的肝損傷模型中，17-OH PREG 同樣展現(xiàn)出強(qiáng)效的組織保護(hù)作用。
 
實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，即使在 DOX 或 IR 誘導(dǎo)損傷 24 小時(shí)后給予 17-OH PREG，仍能顯著減輕由鐵死亡引發(fā)的肝損傷。類似的保護(hù)作用在 IR 誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中也得到了驗(yàn)證，表明 17-OH PREG 對(duì)多種組織損傷具有廣泛的保護(hù)效果。
 
此外，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了 17-OH PREG 在代謝相關(guān)性脂肪肝病（MAFLD）和代謝功能障礙相關(guān)性脂肪性肝炎（MASH）中的作用。結(jié)果顯示，MASH 模型中，17-OH PREG 顯著延緩了 MASH 的進(jìn)展、鐵死亡以及肝損傷。相較之下，GPR56 基因敲除的小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的脂質(zhì)積累和肝損傷。進(jìn)一步分析顯示，在 MASH 模型和 MAFLD 患者中，17-OH PREG 和 GPR56 水平顯著上調(diào)，而 CD36 水平下降，表明 GPR56/17-OH PREG-CD36 軸在 MASH 的進(jìn)展中起到了關(guān)鍵作用。
   
(A) 來(lái)自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在指定處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像。比例尺，50 μm。  
(B–D) 代表性的免疫組織化學(xué)圖像 (B) 和 免疫組織化學(xué)評(píng)分 (C) 4-HNE 染色（n = 4）以及來(lái)自肝臟組織的相對(duì) Ptgs2 mRNA 水平 (D)（n = 6） 的 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在指定處理下的結(jié)果。比例尺，100 μm。  
(E 和 F) 來(lái)自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠在 IR 處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像、免疫組織化學(xué)圖像 (E) 和免疫組織化學(xué)評(píng)分 (F) 4-HNE。H&E 圖像比例尺，50 μm。4-HNE 免疫化學(xué)圖像比例尺，20 μm。每組 n = 4 只小鼠。  
(G–I) 相對(duì) Ptgs2 mRNA 水平 (G) 和來(lái)自 Gpr56fl/fl 或 Alb-Cre+/Gpr56fl/fl 小鼠肝臟組織的相對(duì)血清 ALT (H) 或 AST (I) 水平。每組 n = 3–5 只小鼠。  
(J) 在小鼠中進(jìn)行慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)的策略示意圖，包含指定的處理。小鼠在注射 17-OH PREG 之前先用 MCDD 喂養(yǎng) 1 周，然后每隔一天注射一次 17-OH PREG，并繼續(xù)喂養(yǎng) 2 周。收集血樣和肝臟組織進(jìn)行分析。  
(K) 來(lái)自 WT 小鼠在指定處理下的肝臟組織的代表性 H&E 圖像（上）和油紅 O 染色（下）。H&E 圖像比例尺，20 μm。油紅 O 染色比例尺，200 μm。  
(L) WT 小鼠在指定處理下肝臟組織的油紅 O 染色定量分析。每組 n = 6 只小鼠。  
(M 和 N) WT 小鼠在指定處理下的相對(duì)血清 ALT (M) 或 AST (N) 水平。每組 n = 9 只小鼠。  
(O 和 P) 由 LC-MS 分析確定的來(lái)自非 MAFLD 和 MAFLD 患者的血清 (O) 和肝臟 (P) 中的 17-OH PREG 濃度。血清 (n = 8) 和肝臟 (n = 4)。

小結(jié)
綜上，該研究首次揭示了GPR56 在鐵死亡和肝損傷中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟特異性缺失GPR56的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的鐵死亡和肝損傷特征。GPR56通過(guò)抑制多不飽和脂肪酸（PUFA）的攝取及下調(diào)CD36的表達(dá)來(lái)阻斷鐵死亡。這一機(jī)制并不依賴經(jīng)典的蛋白降解途徑，而是通過(guò)內(nèi)吞-溶酶體途徑發(fā)揮作用。
 
此外，研究通過(guò)篩選類固醇代謝物，發(fā)現(xiàn)17α-羥基孕烯醇酮（17-OH PREG）是GPR56的內(nèi)源性配體，能夠激活GPR56，抑制鐵死亡，并在體內(nèi)外模型中顯著減輕肝損傷。該研究為鐵死亡相關(guān)疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用前景。

科研助力
除了以上研究中提到的 17-OH PREG 、Sulfosuccinimidyl oleate sodium、CCK-8、阿霉素（DOX）、 Ferrostatin-1（Fer-1）以及 deguelin 外，還可為您提供：
 
TargetMol GPCR 靶向化合物庫(kù)，由 2223 種與 G 蛋白及其耦聯(lián)受體相關(guān)的生物活性小分子化合物的特有集合。用于GPCR 靶向的藥物研發(fā)，GPCR 相關(guān)科學(xué)研究和藥物篩選，可用于高通量、高內(nèi)涵篩選。
 
TargetMol 鐵死亡化合物庫(kù)，收集了 779 種與鐵死亡通路相關(guān)的化合物，靶點(diǎn)包括 GPX4、ROS、p53、Nrf2等，另外還包含了鐵螯合劑、抗氧化劑等多種類型小分子，助力您鐵死亡通路相關(guān)的靶點(diǎn)鑒定和藥物研發(fā)。