細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實質(zhì)就是將細(xì)胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質(zhì),最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。

一、RNA提取的使用目的：

通過總RNA提取可獲得高純度及高質(zhì)量的總RNA,可用于實時熒光定量PCR、Northern blot、microRNA檢測、芯片分析, DNA文庫構(gòu)建,基因克隆等實驗。RNA用于不同的后續(xù)實驗,其質(zhì)量要求不盡相同。

• cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留;
• Northern對RNA完整性要求較高,對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低;
• RT-PCR對RNA完整性要求不太高,但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此,明確實驗?zāi)康氖沁M(jìn)行后續(xù)實驗的首要條件。

 
二、RNA提取的方法：

RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在勻質(zhì)化或溶解樣品中,Trizol試劑可保持RNA的完整性,同時能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后,裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。

水相轉(zhuǎn)移后,RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可從中間相沉淀得到DNA,加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。

三、提取到質(zhì)量良好的RNA方法技術(shù)：

提取到質(zhì)量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同），概括起來有兩種方法，總結(jié)如下：

1、檢測RNA溶液的吸光度

280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。

1.82.0時，我們認(rèn)為RNA中蛋白或者時其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，不過要注意，當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機(jī)物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運(yùn)。當(dāng)R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。

如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇?xì)埩�，其值大�?.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。

2、RNA的電泳圖譜

一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進(jìn)行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。

電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。

以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長時間進(jìn)行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當(dāng)然這時你的實驗也就完了。

四、RNA提取實驗操作步驟：

準(zhǔn)備試劑:

氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)。

操作步驟:

1、勻漿處理

a)植物組織:

以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超過1min.,大約100mg 葉片使用1 ml Trizol.

b)動物組織:

以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70℃凍存組織,每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理.樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%.

c)單層培養(yǎng)細(xì)胞：

直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細(xì)胞,每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次.

注意:Trizol加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定,不是由細(xì)胞數(shù)決定.如果Trizol加量不足,可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染.

d)細(xì)胞懸液:

離心取細(xì)胞,每5-10×106動物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌細(xì)胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗滌細(xì)胞,以免降解mRNA。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要勻漿儀處理。

e)血液處理:

直接取新鮮的血液,加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液,混勻后室溫放置10min,10 000rpm 離心1min。棄上清,收集白細(xì)胞沉淀。每1ml血液收集的白細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol。

2、將勻漿樣品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3、可選步驟:4 ℃ 10 000rpm離心10min,取上清。

1）.如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等,可離心去除。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時,上層是大量油脂,應(yīng)除去。取澄清的勻漿溶液進(jìn)行下一步操作。

4、每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈震蕩15s,室溫放置3min。如不能渦旋混勻,可手動顛倒混勻2min代替。

5、4 ℃ 10 000rpm離心10-15min,樣品會分成三層:紅色的有機(jī)相,中間層和上層無色的水相,RNA主要在水相中,把水相(約600ul,約為所用Trizol試劑的60%)轉(zhuǎn)移到新管中。(如要分離蛋白質(zhì)和DNA,可保留黃色的有機(jī)相)

6、在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃ 放置20-30min。

2）、植物或動物組織RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,導(dǎo)致電泳檢測時看不到RNA。可以按以下步驟操作減輕污染:在上清中加入1/2體積的異丙醇,1/2體積的RNA助沉劑,然后進(jìn)行以下操作。

7、4 ℃ 10 000rpm離心10min,去上清。

3）、離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的,離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

8、加入1ml 75%乙醇(DEPC水處理過的水配制)洗滌沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。

9、4 ℃ 10 000rpm離心2min,棄上清;短暫快速離心,用移液器小心吸棄上清,注意不要吸棄沉淀。

10、室溫放置晾干(不要晾得過干,RNA完全干燥后會很難溶解,大約晾干2-3min左右即可)。加入適量DEPC水(根據(jù)實驗需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

RNA提取的注意事項：

1. 從少量樣品中提取RNA(1-10mg組織或102-104細(xì)胞) :

加800ul Trizol,樣品裂解后加氯仿,分層,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原會與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml時不會影響反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成,也不影響PCR反應(yīng)。

2. 勻漿后,加氯仿前,樣品可在-70 ℃放置一個月以上:

RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一個星期或-20 ℃一年以上。如果要長期保存,RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中,-70 ℃長期保存。