文章來(lái)源： ：SinoTalk為承諾發(fā)聲，作者：中新小魚(yú)

人源多能性干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，包括從體內(nèi)胚胎分離獲得的胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)和體外誘導(dǎo)獲得的多能性干細(xì)胞(Human Induced Pluripotent Stem Cells, hiPSCs)。人源干細(xì)胞是進(jìn)行細(xì)胞多能性維持機(jī)理研究、體細(xì)胞重編程機(jī)制研究和疾病發(fā)病機(jī)制研究等基礎(chǔ)研究的重要研究對(duì)象。同時(shí)，人源干細(xì)胞也作為遺傳性疾病治療藥物篩選、體外器官構(gòu)建的“種子”細(xì)胞，在疾病治療和再生醫(yī)學(xué)治療中具有重要價(jià)值。

盡管已經(jīng)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，人源干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)還有待完善。人源干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的一個(gè)重大技術(shù)瓶頸是人源干細(xì)胞在傳代，單細(xì)胞克隆和凍存復(fù)蘇過(guò)程中容易凋亡，導(dǎo)致其存活率非常低。這個(gè)技術(shù)難題對(duì)人源干細(xì)胞的培養(yǎng)，基因編輯，以及人源干細(xì)胞產(chǎn)品的凍存復(fù)蘇都造成巨大的困難。日本科學(xué)家Kiichi Watanabe和Yoshiki Sasai在2009年率先發(fā)現(xiàn)Rho-associated Kinase（ROCK）的抑制劑Y-27632可以有效抑制人源干細(xì)胞在傳代過(guò)程中的細(xì)胞凋亡。Y-27632的發(fā)現(xiàn)極大地優(yōu)化了人源干細(xì)胞的培養(yǎng)流程，目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用。然而，Y-27632并未能徹底解決人源干細(xì)胞凋亡的問(wèn)題。目前，即使在使用Y-27632的條件下，人源干細(xì)胞在單細(xì)胞克隆，以及凍存復(fù)蘇過(guò)程中依然面臨存活極低的困難。這個(gè)技術(shù)瓶頸在過(guò)去十多年中一直困擾著人源干細(xì)胞在基因編輯中的運(yùn)用以及干細(xì)胞產(chǎn)品高效凍存復(fù)蘇的實(shí)現(xiàn).

2021年5月3日， 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心干細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室的陳宇博士，陳璐博士和鄧濤博士等在Nature Methods上發(fā)表論文A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells，首次報(bào)道了一個(gè)顯著提升人源干細(xì)胞在單細(xì)胞克隆和凍存復(fù)蘇過(guò)程中的存活率的四組分配方 CEPT（Chroman1， Emricasan， polyamines 和trans-ISRIB）。CEPT通過(guò)同時(shí)阻斷多個(gè)誘發(fā)人源干細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)了顯著提升人源干細(xì)胞在多種極端條件下的存活率。

圖1. 干細(xì)胞存活篩選示意圖。

論文作者首先發(fā)展了監(jiān)測(cè)人源干細(xì)胞存活的藥物高通量篩選實(shí)驗(yàn)體系，然后通過(guò)藥物高通量篩選平臺(tái)測(cè)試了15333個(gè)化合物。在他們發(fā)現(xiàn)的113個(gè)具有活性的化合物中，Chroman1是一個(gè)非常有效的ROCK抑制劑。它比目前廣泛使用的Y-27632對(duì)ROCK的抑制更加有效，同時(shí)選擇性更好。

圖2. 干細(xì)胞存活組合篩選示發(fā)現(xiàn)Chroman1和Emricasan

隨后，作者從113個(gè)有活性的化合物中挑選了29個(gè)代表不同作用機(jī)制的化合物進(jìn)行了組合篩選（Matrix Screen）。通過(guò)測(cè)試812個(gè)組合，作者發(fā)現(xiàn)Chroman1和Caspase抑制劑Emricasan有明顯的協(xié)同作用。同時(shí)使用Chroman1和Emricasan可以顯著減少人源干細(xì)胞在細(xì)胞傳代過(guò)程中的凋亡。

圖3. 干細(xì)胞存活三個(gè)化合物的組合篩選示發(fā)現(xiàn)Chroman1+Emricasan+tISRIB

人源干細(xì)胞存活的極限挑戰(zhàn)是單細(xì)胞克隆。在這個(gè)流程中，通過(guò)流式細(xì)胞儀每一個(gè)干細(xì)胞被單獨(dú)放到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中，讓其成長(zhǎng)為一個(gè)新的單細(xì)胞克隆。在目前的干細(xì)胞培養(yǎng)方法下，單個(gè)干細(xì)胞能夠成功成長(zhǎng)為單細(xì)胞克隆的機(jī)會(huì)非常小。這常常成為干細(xì)胞基因編輯的路障。在發(fā)現(xiàn)Chroman1和Emricasan（C+E）的協(xié)同作用后，作者在干細(xì)胞單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了C+E的效果。作者吃驚的發(fā)現(xiàn)C+E并不能夠提高干細(xì)胞單細(xì)胞克隆的效率。這個(gè)結(jié)果讓作者認(rèn)識(shí)到干細(xì)胞在單細(xì)胞克隆過(guò)程中面臨著細(xì)胞低密度條件下特殊的生存壓力。為了尋找能夠緩解這種特殊壓力的化合物，作者進(jìn)一步發(fā)展了在低細(xì)胞密度下進(jìn)行藥物高通量篩選的實(shí)驗(yàn)體系。通過(guò)在低細(xì)胞密度下進(jìn)行第三輪藥物高通量篩選，作者非常幸運(yùn)地發(fā)現(xiàn)tISRIB可以顯著增加干細(xì)胞在低密度條件下的存活率。tISRIB 是University of California, San Francisco (UCSF) Peter Walter實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的Integrated Stress Response的抑制劑。因此，這一研究發(fā)現(xiàn)表明Integrated Stress Response在干細(xì)胞的存活中有著重要作用。同時(shí)，通過(guò)測(cè)試多種細(xì)胞培養(yǎng)添加組分作者也發(fā)現(xiàn)polyamines也可以促進(jìn)干細(xì)胞在單細(xì)胞克隆過(guò)程中的存活。最終，作者發(fā)現(xiàn)同時(shí)使用Chroman1, Emricasan, polyamines, 和tISRIB（CEPT）可以將干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆率提升到40%以上。

在提升了人源干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆效率之后，作者測(cè)試了CEPT在干細(xì)胞培養(yǎng)中的其他運(yùn)用。他們發(fā)現(xiàn)CEPT不僅可以減少干細(xì)胞在形成EB過(guò)程中的凋亡，而且可以促進(jìn)EB和微器官的生長(zhǎng)和分化。同時(shí)，CEPT也可以極大的減少干細(xì)胞以及干細(xì)胞產(chǎn)品在凍存復(fù)蘇過(guò)程中的凋亡。因此，CEPT在人源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床運(yùn)用中都有廣闊的運(yùn)用前景。

圖4. CEPT促進(jìn)干細(xì)胞在Embryoid body和凍存復(fù)蘇過(guò)程中的存活

【產(chǎn)品推薦】
逐典PSCprofTM人多能干細(xì)胞消化液專為多能干細(xì)胞設(shè)計(jì)，本產(chǎn)品為溫和消化酶，可進(jìn)行單細(xì)胞傳代，確保在解離細(xì)胞時(shí)最大限度減少細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞傳代存活率，消化時(shí)間3-5分鐘，簡(jiǎn)化了細(xì)胞傳代過(guò)程。本產(chǎn)品無(wú)動(dòng)物來(lái)源，生產(chǎn)過(guò)程嚴(yán)格遵循ISO9001體系，并符合GMP指導(dǎo)原則，確保高質(zhì)量和安全性。

產(chǎn)品特性
1. 溫和高效，傳代存活率高
2. 可進(jìn)行單細(xì)胞傳代
3.檢測(cè)數(shù)據(jù)（iPS細(xì)胞消化實(shí)驗(yàn)）

結(jié)果表明，逐典PSCprofTM人多能干細(xì)胞消化液與同類競(jìng)品在消化效率、消化后細(xì)胞活率無(wú)明顯差異。

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參考文獻(xiàn)
1. Tsujimoto H, Osafune K. Current status and future directions of clinical applications using iPS cells-focus on Japan. FEBS J. 2022;289(23):7274-7291.

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