巨噬細胞——免疫系統(tǒng)的重要成員！  巨噬細胞在各種疾病中充當了怎樣的角色？我們又怎么在實驗室中誘導(dǎo)巨噬細胞并將其進一步分化為不同的亞型呢？讓我們一起來學(xué)習(xí)一下吧~

01
巨噬細胞：功能和作用機制

巨噬細胞，一種白細胞，其生命旅程開始于骨髓，在分化形成巨噬細胞后被釋放到血液中，隨著血液循環(huán)進入各個組織中，并分化成不同的類型，例如大腦中的小膠質(zhì)細胞和肝臟的 Kupffer 細胞。

巨噬細胞的主要功能是吞噬細菌、病毒等病原體，也可以消滅生物體內(nèi)的腫瘤細胞和死亡細胞，在生物體中發(fā)揮“清道夫”的作用。巨噬細胞還可以通過呈遞抗原，分泌趨化因子和細胞因子的方式參與免疫反應(yīng)，激活其他免疫細胞。此外，巨噬細胞參與組織修復(fù)，在移植器官的存活和排異中發(fā)揮作用[1]。

但巨噬細胞也可能成為疾病的幫兇，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，維持病原體在體內(nèi)的存在，或?qū)е陆M織損傷和炎癥反應(yīng)。

圖1. 巨噬細胞吞噬細菌的過程。

圖 2. M1 型和 M2 型巨噬細胞^[2]。

巨噬細胞可以大致分為 M1 和 M2 兩種亞型，M2 可以進一步分為 M2a，M2b，M2c 和 M2d 四種表型。M1 對抗病原體感染，誘導(dǎo)促炎反應(yīng)。M2 促進抗炎反應(yīng)和腫瘤發(fā)展。另外，M2a 主要介導(dǎo)組織修復(fù)；M2b 負責(zé)免疫調(diào)節(jié)；M2c 在吞噬作用中起作用，M2d 參與腫瘤的血管生成。

02
巨噬細胞：如何誘導(dǎo)分化？

在實驗室中通常從外周血單核細胞 (PBMCs) 或人急性單核白血病細胞 THP-1 開始，通過加入特定的分化因子，誘導(dǎo)它們分化為成熟的巨噬細胞。

一、從外周血液誘導(dǎo)巨噬細胞分化

外周血單核細胞可以從血樣中通過密度梯度離心法獲得。

• 將新鮮的抗凝血液樣品與平衡密度梯度介質(zhì)(Ficoll-Hypaque-1077 或 Lymphoprep) 混合。

• 通過低速離心 (400 ×g，30 min) 使不同密度的細胞組分在離心管中形成分層。PBMCs 處于血漿和紅細胞之間的不透明中間層。
• 吸取中層細胞懸液并重復(fù)洗滌 (PBS，4°C，250 ×g，10 min) 直至獲得澄清的上清液[3]。
  
  圖 3. 從血樣中分離外周血單核細胞 (PBMCs)^[4]。

圖 4. 從外周血液誘導(dǎo)巨噬細胞分化^[3]。

 
具體步驟 (供參考)^[3]：

(1) 將分離得到的 PBMCs 加入含有 15% FCS 的 10 mL RPMI 1640 (含有 penicillin，streptomycin 和 2 mM glutamine)。計數(shù)并將細胞濃度調(diào)節(jié)至 1×107 cells/mL。
(2) 將 10 mL 細胞懸浮液加入培養(yǎng)皿中。不要去除不貼壁的細胞。
(3) 在 37°C 下用 5% CO₂ 的加濕培養(yǎng)箱孵育細胞。在 2 天和 4 天后更換新鮮的 RPMI/15% FCS 培養(yǎng)基。
(4) 細胞在第 6 天時已經(jīng)分化為巨噬細胞，并且牢固地貼壁生長。
(5) 取出培養(yǎng)皿并加入 10 mL 冷 PBS，并且置于冰上 30 min。使用細胞刮刀，輕輕地將細胞從板上刮下。
(6) 將細胞以 250 ×g 離心 5 min，并重懸于 RPMI/5% FCS 中并鋪板。
(7) 用新鮮的添加有 10% FCS 的 RMPI 1640 更換培養(yǎng)基。
(8) 加入 10 ng/mL LPS 和 5 U/mL 人重組 IFN-γ (可誘導(dǎo) M1 極化) 或加入 20 ng/mL 人重組 IL-4 (可誘導(dǎo) M2 極化)，在 37°C，5% CO₂ 下孵育 24 h。
(9) 去除上清液并更換培養(yǎng)基 (新鮮的添加有 5% FCS 的RMPI 1640)。
 
注意事項^[3]:

• 選取不超過 8 小時的血樣，實驗效果最佳。

• 單核細胞將在大約 1 小時內(nèi)附著在板上。在這段時間之后，他們將自發(fā)地分離。如果要在小板 (例如 6 孔板或 24 孔板) 中分化細胞，則在用溫 PBS 洗滌細胞后，加入 10 mL RPMI1640/FCS 10%，并在 37°C 和 5% CO₂下孵育過夜。在這段時間之后，單核細胞漂浮在上清液中。用細胞刮刀分離貼壁生長的細胞，以 250 ×g 在 4°C 下離心 5 min，對細胞進行計數(shù)，鋪板。

• 人血清可以從不同的公司獲得。如果您從獻血者處獲得血清，請制作一個不同供體的池，以避免分化細胞之間的差異。使用前，在 56°C 的水浴中加熱 30 min。

• 僅向一個方向移動細胞刮刀。在幾個方向上移動可能會降低細胞活力。

 
二、用 THP-1 細胞誘導(dǎo)巨噬細胞分化

除了從人血樣中分離單核細胞進而分化得到巨噬細胞外，也可以直接誘導(dǎo) THP-1 細胞分化，步驟如下^[5][6]。

▐  細胞培養(yǎng)

▐  誘導(dǎo)巨噬細胞分化 

(1) 將 THP-1 細胞接種在孔板中 (密度為 5 × 10⁵cells/mL)，加入 PMA (濃度為 50-200 ng/mL)，處理細胞 24 h 以誘導(dǎo)分化。

圖 5. PMA (HY-18739) (100, 200 ng/mL) 誘導(dǎo) THP-1 細胞貼壁和分化。 

 
PMA 處理 24 h 后細胞由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，高倍鏡下可看到部分細胞的胞漿里含有大量顆粒狀物質(zhì)，同于之前的透亮狀態(tài); 可觀察到細胞變得更扁平，呈不規(guī)則形，部分細胞有偽足伸出，貼壁呈阿米巴樣生長。(已經(jīng)過 MCE 生物實驗驗證)。

(1) M0 靜息巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用無血清培養(yǎng)基洗滌分化的貼壁細胞兩次，然后在無 PMA 的培養(yǎng)基中靜置 24 h，以獲得 M0 靜息巨噬細胞。

(2) M1 經(jīng)典激活巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 共培養(yǎng)細胞 24 h，以獲得經(jīng)典激活的 M1 型巨噬細胞。

(3) M2 替代激活巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用 20 ng/mL IL-4 和 20 ng/mL IL-13 共培養(yǎng)細胞 24 h，以獲得替代激活的 M2 型巨噬細胞。

03
M1/M2 型巨噬細胞的鑒定

一、形態(tài)學(xué)差異 

• M1 型巨噬細胞：較為扁平，細胞分布分散，伴有較多的假偽足。這些特點有助于它們識別和吞噬病原體。此外，M1 型巨噬細胞的細胞質(zhì)內(nèi)含有大量溶酶體和消化酶，以便分解入侵的病原體^[6]。

• M2 型巨噬細胞：多為圓形體，細胞表面的突起較少。M2 型巨噬細胞的細胞質(zhì)內(nèi)含有更多的吞噬體和細胞器，這些結(jié)構(gòu)參與清除死亡細胞和促進組織再生^[6]。

圖 6. M1 型和 M2 型巨噬細胞的形態(tài)學(xué)特征^[6]。

A. 巨噬細胞在 LPS/IFN-γ 以及 IL4/IL13 的作用下極化為 M1 和 M2 亞型，以及其在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征。B. 左圖：M0/M1/M2 型巨噬細胞在細胞厚度和堅固度方面的形態(tài)描述。右圖：M0/M1/M2 型巨噬細胞在電子顯微鏡下的細胞核 (藍) 和肌動蛋白 (綠) 特征。
 
二、表面標志物

• M1 分泌產(chǎn)生促炎性細胞因子，如 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-12，以及高水平的活性氧 (ROS) 和氮物質(zhì)。

• M2 分泌抗炎性細胞因子，如 IL-10、CCL18 和 CCL22。M2 型巨噬細胞還表達幾種受體，如甘露糖受體 CD206 (或 MRC1)、清除受體 CD163、dectin-1 和 DC-SIGN^[3][7]。

表 1. M1 和 M2 型巨噬細胞分泌的表面標志物^[3][7]。

04
小結(jié)

通過本文的介紹，我們不僅學(xué)習(xí)了巨噬細胞在不同疾病下的功能變化，而且深入探討了其從單核細胞到成熟分化細胞的“升級之路”。巨噬細胞的分化和極化在疾病治療中具有重要的意義，隨著研究的進一步深入，我們也將揭開巨噬細胞的神秘面紗，為多種疾病=治療開發(fā)出新的靶點。