細胞核分離試劑盒的應(yīng)用：探索人脊髓膠質(zhì)細胞異質(zhì)性
影響因子：5.07
伯豪生物產(chǎn)品：伯優(yōu)®細胞核分離試劑盒
研究背景
盡管有大量證據(jù)表明脊髓的神經(jīng)膠質(zhì)細胞在感覺感知和處理以及運動行為中起著關(guān)鍵作用，但其細胞、功能和空間分布的異質(zhì)性在很大程度上仍不清楚。來自單細胞和單細胞核RNA測序（scRNA-seq和snRNA-seq）研究的新興數(shù)據(jù)揭示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）特定神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型之間的細胞和分子異質(zhì)性。Zheng等人過scRNA-seq比較了大腦皮層和脊髓的小膠質(zhì)細胞亞型，在大腦皮層中發(fā)現(xiàn)了三個亞群，在脊髓中發(fā)現(xiàn)了兩個亞群，并顯示了脊髓和皮層小膠質(zhì)細胞之間的不同亞群。Floriddia等人也使用scRNA-seq將小鼠CNS中的成熟少突膠質(zhì)細胞分為六個不同的亞群，這些亞群對脊髓損傷表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。雖然對小鼠CNS中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞和功能異質(zhì)性已有相對較好的了解，但技術(shù)障礙和高質(zhì)量組織樣本獲取受限限制了人類脊髓研究方面的此類進展。
研究目的
通過空間轉(zhuǎn)錄組學和snRNA-seq來繪制人類脊髓中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的異質(zhì)性。并通過比較人類和小鼠的轉(zhuǎn)錄組譜來探討種間異質(zhì)性。通過本研究的探索和驗證人類脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞的功能和空間分布，有望成為未來研究神經(jīng)膠質(zhì)細胞相關(guān)人類生理和病理條件分子基礎(chǔ)的重要資源。
伯豪產(chǎn)品
伯優(yōu)®細胞核分離試劑盒
研究結(jié)果
1. 神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型的鑒定
為了實現(xiàn)單細胞分辨率，本研究對來自9名成人腰椎膨大區(qū)域的脊髓中分離出的64,021個細胞核進行了單細胞核RNA測序（snRNA-seq）。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們確定了八種主要細胞類型，它們具有獨特的分子標記物。星形膠質(zhì)細胞（占總細胞核的5.2%）通過表達代表性標記物AQP4、ATP1A2和SLC1A2進行鑒定；小膠質(zhì)細胞（占總細胞核的13.1%）通過PTPRC、CTSS和ITGAM進行鑒定；少突膠質(zhì)細胞（占總細胞核的58.8%）則通過MBP、MOBP、MOG和PLP1進行鑒定。
后續(xù)又通過空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索了這三種神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型的空間位置。數(shù)據(jù)表明，星形膠質(zhì)細胞在脊髓中廣泛存在，但在白質(zhì)中的表達高于灰質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)通過免疫熒光染色得到了驗證。小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞則主要分布在白質(zhì)中。
為了確定人類脊髓中每種神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型內(nèi)的異質(zhì)性，根據(jù)它們的轉(zhuǎn)錄特征，將星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞各自分類為六個亞群。在小鼠脊髓中，基于先前的研究結(jié)果，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞分別被分類為五個、四個和五個亞群。通過進一步分析每個亞群中獨特高表達的代表性標記基因，最終鑒定出與軀體感覺系統(tǒng)障礙相關(guān)的幾種標記基因。這些包括：人類星形膠質(zhì)細胞亞群1（C1）中的CACNB2（鈣電壓門控通道輔助亞基β2）；人類星形膠質(zhì)細胞亞群3（C3）和小鼠少突膠質(zhì)細胞亞群5（C5）中的SCN7A（鈉電壓門控通道α亞基7）；人類小膠質(zhì)細胞亞群1（C1）中的GRID2（谷氨酸離子型受體δ型亞基2）；小鼠小膠質(zhì)細胞亞群2（C2）中的Ctss（組織蛋白酶S）；以及小鼠少突膠質(zhì)細胞亞群1（C1）中的Grm3（代謝型谷氨酸受體3）。
2. 神經(jīng)膠質(zhì)亞型的細胞間通訊分析和RNA速度分析
為了探究不同亞型星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞之間的相互作用，研究又分析了相互作用的強度和數(shù)量。發(fā)現(xiàn)所有亞型的神經(jīng)膠質(zhì)細胞均存在關(guān)聯(lián)，其中星形膠質(zhì)細胞C1和C5之間聯(lián)系尤為緊密。接下來，我們比較了每種細胞類型的傳出和傳入相互作用強度。不同亞型的脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞參與的信號通路在活躍程度上存在顯著差異。一些神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型表現(xiàn)出重疊的信號通路，如小膠質(zhì)細胞C1和少突膠質(zhì)細胞C1及C2。
3. 神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型的空間可視化
接下來，研究利用空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索了神經(jīng)膠質(zhì)亞型的空間位置。從最具代表性的腰椎膨大節(jié)段中選擇空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并用每個樣本的相應(yīng)節(jié)段進行分析，最終確定了五種主要的細胞亞型。利用SpaCET軟件，將每個樣本的snRNA-seq數(shù)據(jù)與相應(yīng)的空間切片相結(jié)合，以表征神經(jīng)膠質(zhì)亞型的分布模式。為了更詳細地分析不同神經(jīng)膠質(zhì)亞型的空間分布，研究將人類脊髓灰質(zhì)分為三個區(qū)域：淺背角（板層I-II）、深背角（板層III-VI）和腹角（板層VII-IX）（Todd, 2010）。小膠質(zhì)細胞C2和C5，以及少突膠質(zhì)細胞C3和C5，主要分布在淺背角；星形膠質(zhì)細胞C2、C5和C6，小膠質(zhì)細胞C3和C6，以及少突膠質(zhì)細胞C1、C2和C4，則出現(xiàn)在深背角；而小膠質(zhì)細胞C1和少突膠質(zhì)細胞C6則位于腹角。
4. 人與鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細胞亞型異質(zhì)性
在UMAP分析中，人類脊髓的整體膠質(zhì)細胞數(shù)據(jù)與小鼠的數(shù)據(jù)重疊良好。然而，按細胞類型細分數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠和人類在所有類型的膠質(zhì)細胞（包括星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞）中都存在顯著的異質(zhì)性。為了更深入地了解人類和小鼠之間經(jīng)典脊髓標志物的保守性和差異性，后續(xù)分析了這些標志物在兩種物種中的表達譜。這些標志物包括眾所周知的離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體、神經(jīng)肽和轉(zhuǎn)錄因子。
首先，研究分析了膠質(zhì)細胞亞群之間多個基因表達的差異。在星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中，多個基因的表達水平在亞群之間顯示出顯著的異質(zhì)性。這些基因包括NALCN、Kcnj10、GRM3、Gria2、SOX5、CACNA1D、RORA和KCND2。
接下來，研究還比較了人類和小鼠膠質(zhì)細胞中這些標志物基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)�？傮w而言，轉(zhuǎn)錄模式在人類和小鼠之間存在顯著差異。在人類脊髓的星形膠質(zhì)細胞中，CACNA1C的表達顯著高于CACNA1E和CACNA1A；而在小鼠脊髓的星形膠質(zhì)細胞中，這些基因的表達沒有顯著差異。在人類脊髓星形膠質(zhì)細胞中，GRINA的表達高于GRIN3A，而在小鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞中則相反。在人類脊髓星形膠質(zhì)細胞中，SOX5的表達高于RORB和ESRRG，而在小鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞中，它們的表達水平相當。在人類脊髓小膠質(zhì)細胞中，KCND2和KCND3的表達水平相當，而在小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞中，Kcnd2的表達水平高于Kcnd3。在人類脊髓小膠質(zhì)細胞中，OPRM1的表達高于HTR4；而在小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞中，兩者表達無顯著差異。在人類脊髓小膠質(zhì)細胞中，ZFHX3的表達高于RORA，而在小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞中則相反。在小鼠脊髓少突膠質(zhì)細胞中，Kcnq3的表達高于Kcnq1；而在人類脊髓少突膠質(zhì)細胞中，它們的表達相似。
5. 神經(jīng)膠質(zhì)細胞中與疾病相關(guān)的基因
首先，本研究探索了兩種慢性疼痛（神經(jīng)病理性和炎癥性）相關(guān)的基因表達模式。在星形膠質(zhì)細胞中，常見的神經(jīng)病理性/炎癥性疼痛基因RNF19A/Rnf19a在人類中高表達，但在小鼠中不表達，而GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的基因HMGB1/Hmgb1和DPYSL2/Dpysl2在人類星形膠質(zhì)細胞中高表達，但在小鼠中僅略有表達。DNMT3A/Dnmt3a在小鼠星形膠質(zhì)細胞中高表達，但在人類中僅略有表達。然而，與炎癥性疼痛相關(guān)的基因PRKCA/Prkca在人類和小鼠星形膠質(zhì)細胞中均表現(xiàn)出高表達水平。
在小膠質(zhì)細胞中，GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)的基因HMGB1/Hmgb1、MAPK14/Mapk14、PIK3CB/Pik3cb和CRK/Crk在人類中高表達，但在小鼠中僅略有表達。與炎癥性疼痛相關(guān)的基因P2RX4/P2rx4在人類中高表達，但在小鼠中僅略有表達。在少突膠質(zhì)細胞中，GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。GRAP2/Grap2在人類C5中高表達，但在小鼠中僅略有表達。與小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞一樣，PRKCA/Prkca在人類和小鼠少突膠質(zhì)細胞中均表現(xiàn)出高表達。
6. 神經(jīng)膠質(zhì)細胞簇的功能分配
為了探索每種膠質(zhì)細胞中富集基因的功能特性，進行了GO術(shù)語分析，結(jié)果揭示了人類和小鼠之間幾個共同的生物過程。人類和小鼠星形膠質(zhì)細胞中的富集基因主要與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，包括細胞-細胞粘附、細胞外基質(zhì)組織、樹突形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和細胞遷移。在人類和小鼠的小膠質(zhì)細胞中，富集基因主要與免疫反應(yīng)有關(guān)，包括抗原加工和呈遞、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)、T細胞增殖以及參與炎癥反應(yīng)的白三烯產(chǎn)生。在人類和小鼠的少突膠質(zhì)細胞中，富集基因主要與髓鞘形成有關(guān)，包括髓鞘形成、軸突導(dǎo)向、軸突包繞、髓鞘形成的調(diào)節(jié)和軸突發(fā)生。
7. 人類脊髓膠質(zhì)細胞基因表達的性別差異
通過對男性和女性人類不同脊髓膠質(zhì)亞群中的基因表達模式進行比較，發(fā)現(xiàn)當FC（倍數(shù)變化）≥1.33且調(diào)整后的P值<0.05時，將基因分類為差異表達。值得注意的是，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞中基因表達的最大差異與參與X染色體失活的性別特異性基因（如XIST）和Y染色體基因（包括UTY、USP9Y、TTTY14和NLGN4Y）有關(guān)，這為我們結(jié)果的可靠性提供了有力支持。
在人類脊髓的所有星形膠質(zhì)細胞群中，與女性相比，男性NEAT1和CHI3L1的表達水平較高，而CST3的表達水平較低。值得注意的是，與女性相比，男性在星形膠質(zhì)細胞C5中的NEAT1和在C2及C5中的CHI3L1表達水平也較低。在星形膠質(zhì)細胞C1中，與女性相比，男性MT3的表達水平較高，而NEAT1、EGLN3和CHI3L1的表達水平較低。在星形膠質(zhì)細胞C4中，與女性相比，男性SLC14A1、TRPM3和CACNB2的表達水平較高，而SLC38A1、Dpysl3和NEAT1的表達水平較低。
在人類脊髓的所有小膠質(zhì)細胞群中，所有差異表達基因（DEGs）均位于X染色體和Y染色體上。在小膠質(zhì)細胞C1中，與女性相比，男性ROR2的表達水平較低。在小膠質(zhì)細胞C6中，與女性相比，男性MT-ATP6的表達水平較高，而CHI3L1的表達水平較低。
在人類脊髓的所有少突膠質(zhì)細胞群中，與男性相比，女性MT-ND4、MT2A、MT-ATP6、MT-CO3、MT-ND2、MT-ND3和MT-CO2的表達水平較高。在少突膠質(zhì)細胞C4中，與男性相比，女性PLP1和HMGB1的表達水平較高，而SIAH1的表達水平較低。在少突膠質(zhì)細胞C6中，女性MOBP的表達水平高于男性。
研究總結(jié)
本研究利用（snRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，繪制了人類脊髓中星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的細胞及分子異質(zhì)性圖譜。結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞各自被分為6個不同的轉(zhuǎn)錄組亞群，揭示了人類和小鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型中存在顯著的物種間異質(zhì)性。此外，研究還檢測到人類脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的性別特異性基因表達差異。這些發(fā)現(xiàn)為脊髓相關(guān)疾病的研究提供了重要資源。
參考文獻：
https://doi.org/10.7554/eLife.92046
