逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的具體操作步驟
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。
RT-PCR操作步驟：
一、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（體積即上一步驟計(jì)算出來(lái)的）
3、剩下的用無(wú)Rnase水補(bǔ)齊共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆轉(zhuǎn)錄試劑
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、設(shè)置儀器，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆轉(zhuǎn)錄：70℃ 5min
3、終止：4℃
附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個(gè)是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作，后面有說(shuō)明。
四、PCR cDNA擴(kuò)增目的基因（反應(yīng)體系是20ul，不夠用無(wú)菌水補(bǔ)齊）
下面的實(shí)驗(yàn)用高壓過(guò)的槍頭和普通高壓過(guò)的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來(lái)即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計(jì)算出后，取出放在ep管中。）
1、加樣：①M(fèi)ix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水總計(jì)9ul
2、混勻：小離心機(jī)甩一下即可
3、放入PCR儀：PCR儀事先設(shè)定條件，反應(yīng)條件根據(jù)mix說(shuō)明書(shū)來(lái)設(shè)定
4、PCR產(chǎn)物保存：一般在4℃冰箱保存，長(zhǎng)時(shí)間不用可-20℃凍存。
五、配膠和跑膠:
1、配膠: （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。
小膠板8孔的 TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g
中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g
步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準(zhǔn))→將沸騰的液體轉(zhuǎn)移到EB污染區(qū)的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個(gè)角倒入防止產(chǎn)生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進(jìn)行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。
2、跑膠:
（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新?lián)Q電泳緩沖液。
（2）要讓緩沖液沒(méi)過(guò)膠。
（3）Marker標(biāo)記染色體上一個(gè)可以被識(shí)別的區(qū)域，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。
步驟：取PCR產(chǎn)物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負(fù)極到正極）,當(dāng)loading Buffer跑到2/3時(shí)停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺(tái)上。
六、照相
注意事項(xiàng)：
1、組織或細(xì)胞量過(guò)少，可酌情減少Trizol 用量
2、組織或細(xì)胞量過(guò)多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染
3、高蛋白、高脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿后須2-8℃，12000g離心5min去除不溶物，再進(jìn)行下面操作，若上層有脂肪物，則也須去除。
4、熱天提RNA，戴手套是必須的，手是Rnase的主要來(lái)源。
5、勻漿時(shí)，組織塊不宜過(guò)大，先用組織剪將組織剪碎，然后再充分勻漿。
6、對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行處理。主要有以下幾點(diǎn)，(1) 研磨過(guò)程使用的研缽需要高溫干燥處理后使用。(2) 實(shí)驗(yàn)中使用的EP管，槍頭等塑料制品，需要用DEPC水浸泡24小時(shí)后，經(jīng)高溫滅菌干燥使用。(3) 為了防止Rnase的污染，用DEPC水替代三蒸水進(jìn)行溶液的配制。(4) RNA操作中使用專用的器械，有條件的也可以設(shè)置專用實(shí)驗(yàn)室。
7、外源性的RNase會(huì)污染玻璃、塑料制品、實(shí)驗(yàn)器械、及各種實(shí)驗(yàn)試劑。操作過(guò)程中，手套是最容易污染樣品的，因此手套要勤換。實(shí)驗(yàn)人員說(shuō)話過(guò)程中所帶的唾液會(huì)降解樣品，故需帶口罩操作。在RNA整個(gè)提取過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員熟練快速的完成整個(gè)RNA的提取，減少實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間。
RT-PCR操作步驟：
一、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系要20ul）依次加入
1、Oligo（dT）加入1ul。
2、RNA（體積即上一步驟計(jì)算出來(lái)的）
3、剩下的用無(wú)Rnase水補(bǔ)齊共12ul 65℃水浴5min。
二、加入逆轉(zhuǎn)錄試劑
1、5×Reaction Buffer 4ul
2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul
3、10mM Dntp mix 2ul
4、RevertAid m-mul URT 1ul
三、設(shè)置儀器，按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置
1、oligodT：42℃ 60min
2、逆轉(zhuǎn)錄：70℃ 5min
3、終止：4℃
附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個(gè)是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作，后面有說(shuō)明。
四、PCR cDNA擴(kuò)增目的基因（反應(yīng)體系是20ul，不夠用無(wú)菌水補(bǔ)齊）
下面的實(shí)驗(yàn)用高壓過(guò)的槍頭和普通高壓過(guò)的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來(lái)即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計(jì)算出后，取出放在ep管中。）
1、加樣：①M(fèi)ix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水總計(jì)9ul
2、混勻：小離心機(jī)甩一下即可
3、放入PCR儀：PCR儀事先設(shè)定條件，反應(yīng)條件根據(jù)mix說(shuō)明書(shū)來(lái)設(shè)定
4、PCR產(chǎn)物保存：一般在4℃冰箱保存，長(zhǎng)時(shí)間不用可-20℃凍存。
五、配膠和跑膠:
1、配膠: （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。
小膠板8孔的 TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g
中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g
步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準(zhǔn))→將沸騰的液體轉(zhuǎn)移到EB污染區(qū)的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個(gè)角倒入防止產(chǎn)生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進(jìn)行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。
2、跑膠:
（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新?lián)Q電泳緩沖液。
（2）要讓緩沖液沒(méi)過(guò)膠。
（3）Marker標(biāo)記染色體上一個(gè)可以被識(shí)別的區(qū)域，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。
步驟：取PCR產(chǎn)物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負(fù)極到正極）,當(dāng)loading Buffer跑到2/3時(shí)停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺(tái)上。
六、照相
注意事項(xiàng)：
1、組織或細(xì)胞量過(guò)少，可酌情減少Trizol 用量
2、組織或細(xì)胞量過(guò)多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染
3、高蛋白、高脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿后須2-8℃，12000g離心5min去除不溶物，再進(jìn)行下面操作，若上層有脂肪物，則也須去除。
4、熱天提RNA，戴手套是必須的，手是Rnase的主要來(lái)源。
5、勻漿時(shí)，組織塊不宜過(guò)大，先用組織剪將組織剪碎，然后再充分勻漿。
6、對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行處理。主要有以下幾點(diǎn)，(1) 研磨過(guò)程使用的研缽需要高溫干燥處理后使用。(2) 實(shí)驗(yàn)中使用的EP管，槍頭等塑料制品，需要用DEPC水浸泡24小時(shí)后，經(jīng)高溫滅菌干燥使用。(3) 為了防止Rnase的污染，用DEPC水替代三蒸水進(jìn)行溶液的配制。(4) RNA操作中使用專用的器械，有條件的也可以設(shè)置專用實(shí)驗(yàn)室。
7、外源性的RNase會(huì)污染玻璃、塑料制品、實(shí)驗(yàn)器械、及各種實(shí)驗(yàn)試劑。操作過(guò)程中，手套是最容易污染樣品的，因此手套要勤換。實(shí)驗(yàn)人員說(shuō)話過(guò)程中所帶的唾液會(huì)降解樣品，故需帶口罩操作。在RNA整個(gè)提取過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員熟練快速的完成整個(gè)RNA的提取，減少實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間。
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