ELISA試驗(yàn)空白背景高的常見原因和解決方法
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學(xué)原理的一種高靈敏度和高特異性的實(shí)驗(yàn)方法。通常陰性孔吸光光度值不會(huì)超過0.1。ELISA空白背景高的常見原因和處理方法
常見原因及解決方法如下：
1）、洗板不干凈
解決方法：
①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對(duì)照會(huì)顯色，嘗試延長洗板時(shí)間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。
在洗板時(shí)要保證每步都洗滌完全，充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。
②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。
2）、顯色液變質(zhì)或者試劑過期
解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。
3）、試劑稀釋有誤，檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過高
解決方法：按照說明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。
4）、試劑盒組分未平衡
解決方法：試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5）、混用其他試劑盒試劑
解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號(hào)的試劑不要混用。
6）、蒸餾水受酶等污染
解決方法：使用新鮮蒸餾水。
7）、培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長
解決方法：孵育時(shí)間過長、溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃，按照說明書的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育。
8）、酶標(biāo)板底部有污漬
解決方法：在加完終止液之后，檢測(cè)之前，用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部，確認(rèn)沒有污漬之后再檢測(cè)。
9）、洗液被污染
解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用，長期放置會(huì)析出，也可能會(huì)污染，導(dǎo)致背景偏高。
10）、包被的抗原被污染
解決辦法：仔細(xì)回想操作過程，換新的抗原包被。
11）、封閉液、封閉時(shí)間、封閉液的濃度
解決辦法：封閉液（BSA）可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過短導(dǎo)致封閉不徹底，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合，可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景。
12）、抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適
解決辦法：抗體質(zhì)量不高，特異性不好可能會(huì)與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。
若選擇多克隆抗體孵育，可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。
13）、酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤
解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長，不同波長下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別，按照說明書要求設(shè)置參數(shù)。
常見原因及解決方法如下：
1）、洗板不干凈
解決方法：
①充分洗滌：如果洗板的時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致抗體殘留，陰性對(duì)照會(huì)顯色，嘗試延長洗板時(shí)間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。
在洗板時(shí)要保證每步都洗滌完全，充分拍板直至孔內(nèi)沒有明顯的殘留液體。
②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時(shí)避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復(fù)使用。
2）、顯色液變質(zhì)或者試劑過期
解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。
3）、試劑稀釋有誤，檢測(cè)抗體/酶結(jié)合物工作液濃度過高
解決方法：按照說明書推薦的稀釋倍數(shù)稀釋抗體。
4）、試劑盒組分未平衡
解決方法：試劑盒每個(gè)組分都需要平衡至室溫后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
5）、混用其他試劑盒試劑
解決方法：保證使用試劑盒內(nèi)完整的一套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現(xiàn)象，不同批號(hào)的試劑不要混用。
6）、蒸餾水受酶等污染
解決方法：使用新鮮蒸餾水。
7）、培養(yǎng)箱溫度超過37℃或反應(yīng)時(shí)間過長
解決方法：孵育時(shí)間過長、溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩(wěn)定在37℃，按照說明書的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行孵育。
8）、酶標(biāo)板底部有污漬
解決方法：在加完終止液之后，檢測(cè)之前，用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標(biāo)板底部，確認(rèn)沒有污漬之后再檢測(cè)。
9）、洗液被污染
解決方法：洗液現(xiàn)配現(xiàn)用，長期放置會(huì)析出，也可能會(huì)污染，導(dǎo)致背景偏高。
10）、包被的抗原被污染
解決辦法：仔細(xì)回想操作過程，換新的抗原包被。
11）、封閉液、封閉時(shí)間、封閉液的濃度
解決辦法：封閉液（BSA）可能會(huì)與抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。封閉液的濃度偏低、封閉時(shí)間過短導(dǎo)致封閉不徹底，抗體與酶標(biāo)板結(jié)合，可能也會(huì)導(dǎo)致背景偏高，因此可以適當(dāng)調(diào)整封閉液的濃度和時(shí)間以降低背景。
12）、抗體質(zhì)量差或選擇的抗體不合適
解決辦法：抗體質(zhì)量不高，特異性不好可能會(huì)與封閉液（BSA）產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。
若選擇多克隆抗體孵育，可能會(huì)與酶標(biāo)單抗產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景增加，最好選用與酶標(biāo)單抗同種屬的多克隆抗體。
13）、酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)有誤
解決辦法：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置的波長，不同波長下樣品的吸光光度值也會(huì)有很大的差別，按照說明書要求設(shè)置參數(shù)。
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