WB，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

WB實(shí)驗(yàn)步驟：

1、收集蛋白樣品

蛋白提取的質(zhì)量直接決定著 WB 結(jié)果的好壞，因此，根據(jù)標(biāo)本類型和檢測(cè)類型選擇合適的蛋白制備方法是至關(guān)重要的。

使用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品，為了防止蛋白的降解，或保證磷酸化或乙�；�蛋白的穩(wěn)定，需要額外添加蛋白酶抑制劑 / 蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等蛋白抑制劑、或者乙酰化酶抑制劑混合物。

對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白的細(xì)胞核蛋白提取試劑盒 、細(xì)胞漿蛋白細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組分蛋白，也可使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行提取。

收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。目前常用BAC試劑盒測(cè)定樣品蛋白的含量。

2、電泳

（1）蛋白樣品的變性

取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積×蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的sds-page蛋白上樣緩沖液，若樣品是非變性的，可加入非變性的上樣緩沖液。電泳樣品加入樣品處理液后，要經(jīng)過高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)*變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒，可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。

（2）電泳凝膠制備

電泳凝膠的制備可以直接使用sds-page試劑盒進(jìn)行操作。

（3）上樣和電泳

冰上冷卻后，把將處理好的蛋白樣品按照預(yù)定的順序上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)中。注意的是加樣孔有多時(shí)，可加入等體積的上樣緩沖液，最后記得點(diǎn)上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker。預(yù)染Marker便于在電泳過程中監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分離，也可以在隨后的轉(zhuǎn)膜步驟中指示轉(zhuǎn)移效率。Marker也用樣品緩沖液調(diào)整至與樣品等體積。

加足夠的電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

3、轉(zhuǎn)膜

（1）、*常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF膜。

（2）、在加電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

（3）、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。

（4）、要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕除去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）

4、封閉

雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。常用的封閉試劑有 5%的BSA或者脫脂奶粉，緩沖液一般選擇 PBST或者TBST，或者封閉液。

一般封閉條件為：室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2h，特殊情況也可 4℃過夜。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。

封閉完成后要進(jìn)行洗膜，以去除膜上未結(jié)合的封閉試劑。

5、一抗和二抗孵育

一抗孵育

按照適當(dāng)比例用TBST或者一抗稀釋液稀釋一抗。

吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1～2小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。

回收一抗。然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌6次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

二抗孵育

按照適當(dāng)比例用TBST或者二抗稀釋液稀釋二抗

吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1～2小時(shí)。

然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。同時(shí)短時(shí)間多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分鐘）比 長時(shí)間少次數(shù)的洗膜更有效。

Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通常可以選用Tubulin抗體、Actin抗體或GAPDH抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。

6、顯色反應(yīng)

底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時(shí)間后會(huì)越來越弱，要控制好時(shí)間）

7、蛋白膜的重復(fù)利用

如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液或者TBST處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。