RNA提取主要用到的試劑以及相關(guān)原理介紹
RNA提取主要用到的試劑以及相關(guān)原理：
Trizol主要成分：苯酚和異硫氰酸胍；原理是裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。
氯仿：分子量較大的有機(jī)溶劑，可抽提酸性苯酚；氯仿密度大，使有機(jī)相和水層分離。RNA提取過程中，苯酚與蛋白結(jié)合進(jìn)入有機(jī)相中，使蛋白與RNA脫離，RNA進(jìn)入水相。在EP管中會出現(xiàn)上層是RNA，中層白色的是DNA，下層是蛋白質(zhì)。
異丙醇：其-OH為親水基團(tuán)，與水更好的結(jié)合從而使RNA脫水產(chǎn)生沉淀。
DEPC水：RNA酶抑制劑和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性。
RNA提取步驟：
1. Trizol裂解細(xì)胞或組織，充分裂解；
2. 氯仿抽提，每管200ul氯仿，劇烈晃動(dòng)混勻，冰上靜置10min;
3. 12000rpm,4℃離心15min;
4. 小心吸取上清液（一般吸取400ul）至于新的EP管中，可看到溶液分三層，上層澄清透明的是含RNA的水相，中層白色絮狀物是DNA，下層粉紅色是含蛋白質(zhì)的有機(jī)相。
5. 加入等體積（400ul）的異丙醇進(jìn)行脫水，上下顛倒10~15次，輕柔的混勻，冰上靜置10~30min;
6. 12000rpm,4℃離心10min;
7. 離心后可看見管壁有白色沉淀，如若沒有，可重復(fù)步驟6，再離心；后棄掉上清液，緩緩倒出上清液，注意不要將沉淀倒出，加入75%乙醇（無水乙醇：DEPC水=3:1）上下顛倒，直至沉淀離開管壁（清洗RNA沉淀）
8. 12000rpm,4℃離心5min;
9. 再次清洗（棄掉上清液，緩緩倒出上清液，注意不要將沉淀倒出，加入75%乙醇，上下顛倒，直至沉淀離開管壁；
10. 12000rpm,4℃離心5min;
11. 棄掉上清液，將EP管倒扣在干凈的濾紙上，吸干EP管內(nèi)殘留的液體，保證管內(nèi)僅剩RNA沉淀；
12. 加入一定量的DEPC水（根據(jù)RNA沉淀的大小加，一般10~20ul），瞬離，輕彈EP管，保證沉淀溶于DEPC水中后，再次瞬離，RNA完全溶解后，至于-80℃保存。
Trizol主要成分：苯酚和異硫氰酸胍；原理是裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。
氯仿：分子量較大的有機(jī)溶劑，可抽提酸性苯酚；氯仿密度大，使有機(jī)相和水層分離。RNA提取過程中，苯酚與蛋白結(jié)合進(jìn)入有機(jī)相中，使蛋白與RNA脫離，RNA進(jìn)入水相。在EP管中會出現(xiàn)上層是RNA，中層白色的是DNA，下層是蛋白質(zhì)。
異丙醇：其-OH為親水基團(tuán)，與水更好的結(jié)合從而使RNA脫水產(chǎn)生沉淀。
DEPC水：RNA酶抑制劑和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性。
RNA提取步驟：
1. Trizol裂解細(xì)胞或組織，充分裂解；
2. 氯仿抽提，每管200ul氯仿，劇烈晃動(dòng)混勻，冰上靜置10min;
3. 12000rpm,4℃離心15min;
4. 小心吸取上清液（一般吸取400ul）至于新的EP管中，可看到溶液分三層，上層澄清透明的是含RNA的水相，中層白色絮狀物是DNA，下層粉紅色是含蛋白質(zhì)的有機(jī)相。
5. 加入等體積（400ul）的異丙醇進(jìn)行脫水，上下顛倒10~15次，輕柔的混勻，冰上靜置10~30min;
6. 12000rpm,4℃離心10min;
7. 離心后可看見管壁有白色沉淀，如若沒有，可重復(fù)步驟6，再離心；后棄掉上清液，緩緩倒出上清液，注意不要將沉淀倒出，加入75%乙醇（無水乙醇：DEPC水=3:1）上下顛倒，直至沉淀離開管壁（清洗RNA沉淀）
8. 12000rpm,4℃離心5min;
9. 再次清洗（棄掉上清液，緩緩倒出上清液，注意不要將沉淀倒出，加入75%乙醇，上下顛倒，直至沉淀離開管壁；
10. 12000rpm,4℃離心5min;
11. 棄掉上清液，將EP管倒扣在干凈的濾紙上，吸干EP管內(nèi)殘留的液體，保證管內(nèi)僅剩RNA沉淀；
12. 加入一定量的DEPC水（根據(jù)RNA沉淀的大小加，一般10~20ul），瞬離，輕彈EP管，保證沉淀溶于DEPC水中后，再次瞬離，RNA完全溶解后，至于-80℃保存。
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