貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的實驗流程及注意事項

瀏覽次數(shù)：750　發(fā)布日期：2024-7-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

一、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)介紹

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究以及生物技術(shù)領(lǐng)域中具有舉足輕重的地位。其中，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)作為一種常見的細(xì)胞培養(yǎng)方式，對于研究細(xì)胞的生理、生化特性以及疾病機(jī)制等方面發(fā)揮著重要作用。

貼壁細(xì)胞是指在體外培養(yǎng)條件下，需要依附于特定的支持物表面才能生長和增殖的細(xì)胞類型。這些細(xì)胞通常來源于組織或器官，具有特定的形態(tài)和功能特征。常見的貼壁細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點在于能夠更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境，有助于維持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。通過貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，研究人員可以深入研究細(xì)胞的生長、分化、代謝以及對藥物和外界刺激的反應(yīng)。

二、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的實驗流程

（一）準(zhǔn)備工作
1. 培養(yǎng)室的清潔與消毒：確保培養(yǎng)室處于無菌狀態(tài)，定期對環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒。
2. 培養(yǎng)器具的處理：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液器等器具需要經(jīng)過嚴(yán)格的清洗、烘干和滅菌處理。
3. 培養(yǎng)基的配制：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的培養(yǎng)基，并添加所需的血清、生長因子等成分。

（二）細(xì)胞的復(fù)蘇
1. 從液氮中取出凍存的細(xì)胞管，迅速放入 37℃水浴中，輕輕搖動使其快速解凍。
2. 將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的培養(yǎng)基，離心去除凍存液。
3. 將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基中，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。

（三）細(xì)胞的培養(yǎng)
1. 將接種后的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，設(shè)置合適的溫度（通常為 37℃）、二氧化碳濃度（一般為 5%）和濕度。
2. 定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度等。

（四）細(xì)胞的傳代
1. 當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定密度時，需要進(jìn)行傳代。首先吸出舊的培養(yǎng)基，用 PBS 溶液清洗細(xì)胞。
2. 加入適量的消化液（如胰酶和重組胰酶類似物），在顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。
3. 將細(xì)胞懸液離心，去除上清液，重懸細(xì)胞于新鮮培養(yǎng)基中，按照適當(dāng)?shù)谋壤臃N到新的培養(yǎng)容器中。

（五）細(xì)胞的凍存
1. 選擇處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。
2. 消化收集細(xì)胞，離心后用凍存液重懸細(xì)胞，并分裝到凍存管中。
3. 將凍存管放入程序降溫盒中，按照一定的降溫速率降至 -80℃，然后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。

三、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

（一）無菌操作
1. 在整個實驗過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免微生物污染。
2. 操作前對手部和實驗器具進(jìn)行消毒，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞操作。

（二）培養(yǎng)環(huán)境
1. 保持培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、二氧化碳濃度和濕度的穩(wěn)定。
2. 定期檢查培養(yǎng)箱的性能，確保其正常運行。

（三）細(xì)胞觀察
1. 每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括形態(tài)、密度、有無污染等。
2. 及時發(fā)現(xiàn)問題并采取相應(yīng)的措施，如調(diào)整培養(yǎng)條件、處理污染等。

（四）培養(yǎng)基和血清
1. 選擇合適的培養(yǎng)基和血清，并注意其保質(zhì)期和質(zhì)量。
2. 定期更換培養(yǎng)基，避免營養(yǎng)成分的耗盡和代謝產(chǎn)物的積累。

（五）消化操作
1. 控制消化液的濃度和作用時間，避免過度消化損傷細(xì)胞。
2. 消化過程中在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，及時終止消化。

（六）細(xì)胞傳代
1. 按照適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行傳代，避免細(xì)胞過度稀疏或過度密集。
2. 傳代后的細(xì)胞需要一定的時間來適應(yīng)新的環(huán)境，注意觀察其生長情況。

四、細(xì)胞消化方案和對比

（一）胰酶消化法
優(yōu)點：
廣泛適用性：適用于大多數(shù)貼壁細(xì)胞。
消化效果顯著：能夠快速使細(xì)胞從培養(yǎng)表面解離。
缺點：
可能損傷細(xì)胞：過度消化或消化時間不當(dāng)可能對細(xì)胞造成損害。
對細(xì)胞表面蛋白有影響：可能破壞細(xì)胞表面的某些蛋白結(jié)構(gòu)。

（二）膠原酶消化法
優(yōu)點：
溫和性：對細(xì)胞的損傷相對較小，尤其適用于原代細(xì)胞。
保持細(xì)胞完整性：有助于維持細(xì)胞的形態(tài)和功能。
缺點：
消化時間長：通常需要較長的時間才能達(dá)到理想的消化效果。
成本較高：膠原酶的價格相對較高。

（三）胰酶-EDTA 混合消化法
優(yōu)點：
增強(qiáng)消化效果：結(jié)合了胰酶和 EDTA 的作用，提高解離效率。
縮短消化時間：相比單獨使用胰酶，可能減少消化所需的時間。
缺點：
EDTA 潛在影響：EDTA 可能對細(xì)胞內(nèi)的離子平衡產(chǎn)生一定干擾。

（四）EDTA 消化法
優(yōu)點：
相對溫和：對細(xì)胞的損傷較輕微。
不破壞蛋白：對細(xì)胞表面蛋白結(jié)構(gòu)影響較小。
缺點：
消化能力較弱：單獨使用時，可能無法完全解離細(xì)胞。

五、重組胰酶類似物的介紹

重組胰酶類似物是通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段，利用基因工程和重組 DNA 技術(shù)生產(chǎn)的一種蛋白酶。它的設(shè)計旨在模擬天然胰酶的消化功能，但在性能和特性上進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)。

重組胰酶類似物通常是在特定的微生物宿主（如大腸桿菌、酵母等）中進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)。通過基因工程技術(shù)，可以對胰酶的基因進(jìn)行改造，以獲得具有特定性質(zhì)的酶蛋白，如更高的活性、更好的穩(wěn)定性、更低的免疫原性等。

與傳統(tǒng)的天然胰酶相比，重組胰酶類似物在生產(chǎn)過程中能夠更好地控制質(zhì)量和純度，減少雜質(zhì)和變異性的影響。這使得其在細(xì)胞培養(yǎng)、生物制藥以及生物技術(shù)研究等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。

六、重組胰酶類似物進(jìn)行細(xì)胞消化的優(yōu)點是什么

（一）高效消化
具有較高的酶活性，能夠快速有效地使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)表面解離�？s短消化時間，提高實驗效率。
（二）溫和性
對細(xì)胞的損傷相對較小，有助于維持細(xì)胞的活力和功能。
減少因消化過程導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和死亡。
（三）質(zhì)量穩(wěn)定
由于是通過基因工程生產(chǎn)，其質(zhì)量和活性更穩(wěn)定，批間差異小。為實驗結(jié)果的可重復(fù)性提供保障。
（四）純度高
減少雜質(zhì)的存在，降低對細(xì)胞的潛在不良影響。提高細(xì)胞培養(yǎng)的成功率和質(zhì)量。
（五）易于控制
可以根據(jù)實驗需求精確調(diào)整使用濃度和消化時間。更好地適應(yīng)不同類型的貼壁細(xì)胞和實驗條件。

七、逐典生物 TrypLUS 重組胰酶類似物消化液介紹

逐典生物TrypLUS 消化液是一款即開即用、可常溫放置的無動物源的胰酶替代物。利用微生物重組表達(dá)的胰蛋白酶類似酶，對傳統(tǒng)胰蛋白酶在穩(wěn)定性、純度以及使用便捷度上實現(xiàn)了超越。 TrypLUS 消化液具有高效的消化能力，能夠在較短的時間內(nèi)使貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面解離，同時最大程度地減少對細(xì)胞的損傷。