高質(zhì)量密度梯度分離液。包括 Ficoll-Paque 和 Percoll 產(chǎn)品

Percoll

• PERCOLL 是無(wú)菌的嗎？
  Percoll/Percoll PLUS 在生產(chǎn)過(guò)程中是經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理的，但是由于瓶子的材質(zhì)問(wèn)題，只能在 113℃ 條件下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間為 1 h。目前在官方說(shuō)明書(shū)中不再申明 Percoll/Percoll PLUS 為無(wú)菌的。如果對(duì)滅菌要求較高，可以進(jìn)一步滅菌，條件是 120℃，30 min，但需要從原包裝瓶中轉(zhuǎn)移出來(lái)。Percoll 溶液的高壓滅菌必須在沒(méi)有鹽和蔗糖時(shí)進(jìn)行（建議只對(duì)原液滅菌）。
• PERCOLL 的配制方法有哪些？
  Percoll 的配制一般有兩種方法：
  1. 按照百分比用兩步法計(jì)算：用一份的 1.5M NaCl 或者 2.5M 蔗糖加九份 Percoll 原液，得到 100% 的 SIP 溶液。在此基礎(chǔ)上，比如想要得到 44% 和 67% 的工作液，分別按 0.15M 的 NaCl 或者 0.25M 的蔗糖：SIP=（100-44）：44 和（100-67）：67 的比例取相應(yīng)體積的溶液進(jìn)行配制即可。
  2. 根據(jù)密度進(jìn)行一步法計(jì)算，該計(jì)算方法需要知道最終配制的溶液的密度、細(xì)胞分離液的密度（Percoll 密度范圍 1.130.005 g/ml，具體密度可根據(jù)批次號(hào)在英文官網(wǎng)中查詢(xún) COA 獲得），以及用于稀釋的 buffer 的密度（1.5M 的 NaCl 密度為 1.058 g/ml，2.5M 的蔗糖的濃度為 1.316 g/ml），推薦官網(wǎng)的計(jì)算小程序，鏈接如下：
     https://www.cytivalifesciences.com.cn/zh/cn/support/online-tools/cell-preparation/Percoll-calculator
• PERCOLL 目前可用于哪些種屬和細(xì)胞類(lèi)型？
  Percoll 的應(yīng)用領(lǐng)域很廣，涉及多個(gè)物種多種細(xì)胞類(lèi)型，還可以分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有廣泛的文獻(xiàn)支持。當(dāng)客戶詢(xún)問(wèn)能否做某些應(yīng)用時(shí)，可對(duì)照下圖查詢(xún)是否可以應(yīng)用。

• PERCOLL的保存條件是什么？
  Percoll 在沒(méi)有被打開(kāi)時(shí)，在室溫下可以保存 5 年，打開(kāi)后應(yīng)該保存在 4℃-8℃，盡快用完。Percoll 可以冷凍保存在-18°C 中 6 個(gè)月，如果保存在-18°C，在融化時(shí)會(huì)形成梯度，在使用前必須混合瓶中的內(nèi)含物。
• 用 PERCOLL 分離人不同類(lèi)型的細(xì)胞，是否有可以參考的密度范圍？
  目前有如下所示細(xì)胞類(lèi)型和浮力密度供參考：

• 用兩步法將 PERCOLL 母液配成 25%，32%，47% 等濃度具體操作如何？
  1. 制備 SIP：對(duì)于普通的細(xì)胞，將 9 份 Percoll 加入到 1 份 1.5M NaCl 或 1 份 10×濃縮培養(yǎng)基中，通過(guò)加鹽或者蒸餾水可以最終調(diào)節(jié)到所需要的滲透壓；對(duì)于有鹽存在時(shí)會(huì)發(fā)生聚集的亞細(xì)胞顆粒，可以通過(guò)添加 9 份 Percoll 到 1 份 2.5M 的蔗糖中來(lái)制備 SIP（制成的 SIP 可以理解為 100% 的 Percoll，也有文獻(xiàn)中將 SIP 理解為 90% 的 Percoll，具體看文獻(xiàn)中的做法）
  2. 稀釋到終濃度：對(duì)于細(xì)胞，可以添加 0.15M 的 NaCl，對(duì)于亞細(xì)胞顆�；虿《緞t添加 0.25M 的蔗糖。最終按照比例進(jìn)行稀釋?zhuān)�得到不同百分比的分離液。

Ficoll

• FICOLL 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMC的原理是什么？具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)常見(jiàn)問(wèn)題及原因分別如何？
  根據(jù)細(xì)胞密度的不同進(jìn)行分離。單個(gè)核細(xì)胞的體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞比重較大，為 1.092 左右，淋巴細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重為 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集：血漿和血小板密度較低,，懸浮于分離液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞密度較大，沉于分離液的底部；PBMC 密度稍低于分離液，位于分離液界面之上，移去上層組分就可獲得 PBMC。
• FICOLL 可用于哪些種屬細(xì)胞的分離？
  Ficoll 被用作從外周血、骨髓及臍帶血中分離高活性的單個(gè)核細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）
  1. Ficoll-Paque PLUS 主要用于人外周血中淋巴細(xì)胞的分離，如果待分離的淋巴細(xì)胞來(lái)自其他的組織/種屬，可能無(wú)法獲得淋巴細(xì)胞的最佳產(chǎn)量和純度，需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行優(yōu)化。
  2. 已有在鼠、狗、猴、牛、兔、馬、豬甚至魚(yú)淋巴細(xì)胞分離上的應(yīng)用，具體操作條件可以查詢(xún)對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)（在 Ficoll 操作手冊(cè)上提供了文獻(xiàn)）。
  3. 不滿足條件的種屬或來(lái)源，可以先用 Ficoll 分離出單個(gè)核細(xì)胞，再加一步 Percoll 來(lái)實(shí)現(xiàn)最終的分離目的。
• FICOLL是無(wú)菌的嗎？
  Ficoll 已經(jīng)在 121℃、20 min 進(jìn)行了滅菌，為無(wú)菌狀態(tài)，建議無(wú)菌操作，分次取用即可。再次滅菌的話由于客戶的滅菌設(shè)備等的差異，沒(méi)有推薦的滅菌條件。另外如果滅菌時(shí)沒(méi)有保證蓋子的密封性和穩(wěn)定的溫度，可能會(huì)造成 pH 波動(dòng)。
• FICOLL 的保存條件是什么？
  Ficoll應(yīng)避光儲(chǔ)存于 4-30 °C 之間，在該條件下可以保存 3 年。打開(kāi)后建議存儲(chǔ)于 4-8℃。偶爾短時(shí)冷凍，解凍后來(lái)回反復(fù)倒置，確保溶液的均一。
• 用 FICOLL-PAQUE PLUS 分離 T 淋巴細(xì)胞，可否用塑料管？
  分離時(shí)一般都用塑料管，長(zhǎng)期儲(chǔ)存因?yàn)樾枰�避光，不適合用來(lái)儲(chǔ)存。Ficoll 有泛影酸鈉，需要避光�？梢杂盟芰掀�+錫箔紙短期儲(chǔ)存（兩周）。
• 用 FICOLL 進(jìn)行人外周血中淋巴細(xì)胞的分離時(shí)，淋巴細(xì)胞所處的位置如何，各層分別是哪種細(xì)胞？
  離心完成后，從管底往上依次為紅細(xì)胞-粒細(xì)胞-Ficoll 細(xì)胞分離液-淋巴細(xì)胞-血小板-血漿。在取淋巴細(xì)胞時(shí)要小心將上層的血漿和血小板移除后再吸取淋巴細(xì)胞。

• 用 FICOLL 進(jìn)行人外周血中淋巴細(xì)胞的分離時(shí)，血液樣品和 FICOLL 的比例是如何的？大體積樣品該如何處理？
  1. 按照樣品：Ficoll 的高度比約為 3:2.4 或體積比 4:3 的比例進(jìn)行樣品和分離液的添加。
  2. 大體積樣品可以通過(guò)增加離心管的直徑來(lái)進(jìn)行分離。增加離心管直徑并不影響所需的分離時(shí)間。