• OptiPrep^TM多功能分離液是質(zhì)量濃度為60%（w/v）的碘克砂醇溶液，密度為1.32 g/mL。

• OptiPrep^TM應(yīng)⽤手冊C26“基于密度梯度純化肝⾮實(shí)質(zhì)細(xì)胞”⽐較了⼀些純化這些細(xì)胞的⽅法。

• OptiPrep^TM Reference List RC07“肝和胰腺星狀細(xì)胞”中提供了一個所有使用OptiPrep^TM多功能分離液已發(fā)表論文的全面參考書目：https://diagnostic.serumwerk.com/references-2/cell-references-serumwerk/。

• 如需獲取文本中提到的其他應(yīng)用手冊，http://www.shanjin.com.cn/news/3.html，頁面按數(shù)字即可進(jìn)行查詢。

肝星狀細(xì)胞占肝細(xì)胞總數(shù)的15%，其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的能力被認(rèn)為是肝纖維化的關(guān)鍵事件。因此，⼈們對這些細(xì)胞的分離有相當(dāng)⼤的臨床研究興趣；繼⾎液⽩細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞之后，它們可能是哺乳動物細(xì)胞中研究最⼴泛的細(xì)胞。星狀細(xì)胞（有時稱為脂肪儲存細(xì)胞/fat-storing或 Ito）是⾮實(shí)質(zhì)細(xì)胞 (NPC) 中密度最低的細(xì)胞，與其他 NPC（枯否細(xì)胞/Kupffer cells和內(nèi)⽪細(xì)胞/endothelial cells）不同，它們可以使⽤簡單的單密度梯度或兩步不連續(xù)梯度有效純化⾄90-95%的純度。兩步不連續(xù)梯度⼴泛⽤于需要純化星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞的研究，并在應(yīng)⽤手冊C26中進(jìn)⾏了描述。胰腺星狀細(xì)胞也在慢性胰腺炎中介導(dǎo)纖維化，并且也是組織中密度最⼩的細(xì)胞；因此，在它們的分離純化中使⽤了⾮常相似的梯度策略。

本應(yīng)⽤手冊中的詳細(xì)⽅法僅限于密度梯度分離；制備組織細(xì)胞消化物的⽅法可能在實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)很成熟，僅總結(jié)如下。

• 2a.肝臟消化

通常使⽤組織灌注系統(tǒng)通過膠原酶消化肝臟來制備實(shí)質(zhì)細(xì)胞。然后通過50g差速離心沉降1-4分鐘將這些細(xì)胞與⾮實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離。雖然可以從50g中的上清液分離出⾮實(shí)質(zhì)細(xì)胞，但產(chǎn)率通常較低。最⼴泛使⽤的步驟是⽤膠原酶和鏈霉蛋⽩酶或腸毒素的混合物灌注肝臟，以選擇性地破壞實(shí)質(zhì)細(xì)胞[1,2]。

• 2b.胰腺消化

胰腺細(xì)胞懸浮液的制備遵循更傳統(tǒng)的⽅法，即⽤鏈霉蛋⽩酶和膠原酶在37°C下消化解剖并切碎的組織30分鐘，然后通過不銹鋼⽹上的尼⻰過濾 [3]。

• 2c.細(xì)胞懸浮液

通常將細(xì)胞從粗懸浮液中沉淀出來，并在密度梯度分離之前洗滌⼀次或兩次，以除去任何殘留的酶和/或內(nèi)毒素。還可以添加脫氧核糖核酸酶 I /DNS I酶來降解受損細(xì)胞釋放的任何DNA，否則會導(dǎo)致細(xì)胞聚集。將細(xì)胞懸浮在等滲鹽溶液中；通⽤溶液，如 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS)（如果需要，可添加Ca2+）或配制的溶液：Gey’s 平衡鹽溶液 (GBSS) 通常⽤于肝細(xì)胞。

• Nycodenz®

自1986年以來，Nycodenz®被⼴泛⽤于肝星狀細(xì)胞的純化。最簡單的⽅法之⼀由 Schäfer 等⼈于 1987 年⾸次描述 [4]，其中包括將 28.7% (w/v) Nycodenz®的等滲溶液添加到 NPC 懸浮液中，以將其密度提⾼到約1.072克/毫升（13.2% Nycodenz）。在頂部鋪上⼀層平衡鹽溶液，離⼼后從界⾯上⽅回收星狀細(xì)胞。隨后Gressner 和Zerbe [5] 將密度降低⾄約 1.049 g/ml (8.2% Nycodenz) 以提⾼純度，后者已被⼴泛使⽤（例如參考⽂獻(xiàn)6-9）。細(xì)胞懸液中Nycodenz的最終濃度也可能⾼達(dá) 14.35% [10]。在某些情況下，NPC 細(xì)胞懸液會鋪在 Nycodenz溶液之上，可能是 13% [11]、9% [12] 或 8.2% [13]。在少數(shù)情況下，粗細(xì)胞懸浮液會鋪在8.2% 和 15.6 % (w/v) Nycodenz [14,15] 的不連續(xù)梯度上面，但這種梯度形式通常⽤于星狀細(xì)胞和枯否細(xì)胞的同時分離純化。

使⽤ Nycodenz 純化胰腺星狀細(xì)胞⼏乎完全按照肝細(xì)胞的⽅法進(jìn)⾏ [4,5]，并由 Apte 等⼈⾸次描述 [16]。通常，將粗細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)⾄的濃度約為 11.4% (w/v) [例如參考⽂獻(xiàn) 16-19]，但也有⼀些變化：12% [20]、13.2% [21] 和 15.1% [22]。

• OptiPrep^TM

自 1998 年以來，OptiPrep^TM也被⽤于從肝臟和胰腺中分離星狀細(xì)胞； Bachem 等⼈ [23] 發(fā)表了第⼀篇論⽂，其中細(xì)胞懸浮液被鋪在單密度屏障上，Peterson 和 Rowden [24] 使⽤ 5%、10%、20% 和 25% 碘克沙醇/iodixanol的多層不連續(xù)梯度。將 NPC 懸浮液的密度調(diào)整到略⾼于星狀細(xì)胞的密度的策略（如 Nycodenz）也變得流⾏。與 Nycodenz⼀樣，溶液的最終密度也趨于降低，低⾄ 1.045 g/ml（相當(dāng)于 7.2% w/v 的碘克沙醇濃度）的例子已經(jīng)被報道[3]。

由于 OptiPrep 易于使⽤，以下⽅法基于該試劑的使⽤。然⽽，第 7 部分給出了合適的 Nycodenz 原液的制備及其使⽤。僅給出了漂浮策略，因?yàn)檫@是從主要密度較⼤的混合物中分離出密度最⼩顆粒的成熟⽅法。策略 B 中給出了常規(guī)漂浮⽅法（策略 A）的⼀種變體，其中低密度梯度溶液鋪在調(diào)整到 1.084 g/ml 的 NPC 懸浮液上（⻅圖 1 和 2）。

圖 1：星狀細(xì)胞的分離 策略A

圖 2：星狀細(xì)胞的分離 策略B

策略B是⾸選策略，因?yàn)樾菭罴?xì)胞通過“⼲凈”的分離層與樣品分離； 因此，它們與較致密的細(xì)胞和任何殘留的可溶性成分（例如消化酶和破碎細(xì)胞釋放的任何細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)）完全分離。該策略⼴泛⽤于從⼩⿏脾臟、胸腺和淋巴結(jié)中純化胰島和樹突狀細(xì)胞。

以下⽅法參考自參考⽂獻(xiàn) 2 和 3。

1. Gey’s 平衡鹽溶液 (GBSS) 或 Hank 平衡鹽溶液，含或不含Ca2+/Mg2+ （參⻅注釋 1）。
2. OptiPrep（使⽤前輕輕搖晃瓶⼦）
3. 碘克沙醇 (40% (w/v)) ⼯作溶液：混合 4 體積溶液B和 2 體積溶液A（⻅注釋2）。

所有操作均在 4°C 下進(jìn)⾏。

• 6a.策略 A

1. 將溶液C 與溶液 A 混合，使碘克沙醇的最終濃度為 8.0-11.5% (w/v) 碘克沙醇溶液 ( ρ = 1.050-1.065 g/ml)，并⽤此懸浮最終洗滌的細(xì)胞沉淀�；蛘邔⒓�(xì)胞懸浮在溶液 A 中并與溶液 C 混合以產(chǎn)⽣ 8.0-11.5% 碘克沙醇懸浮液（參⻅注釋 3）。
2. 將 10-20 ml 轉(zhuǎn)移⾄離⼼管中，并在頂部鋪上 8-10 ml 溶液 A（參⻅注釋 4）。
3. 1400 g 離⼼ 15-20 分鐘；允許轉(zhuǎn)⼦在沒有制動器的情況下減速（參⻅注釋 5）。
4. 收集位于溶液 A 和樣品之間界⾯處的細(xì)胞（⻅圖 1）。

• 6b.策略 B

1. 將溶液 C 與溶液 A 混合，使碘克沙醇的最終濃度為 15% (w/v) 碘克沙醇溶液 (  ρ = 1.084 g/ml)，并⽤其懸浮最終洗滌的細(xì)胞沉淀（參⻅注釋 6 和7).
2. ⽤溶液 A 稀釋溶液 C，得到含有 8.0-11.5% (w/v) 碘克沙醇的溶液 (  ρ =1.050-1.065 g/ml）（⻅注釋3）。
3. 將 5-10 ml 該溶液鋪在相同體積的細(xì)胞懸液（15% 碘克沙醇溶液）上；然后在頂部鋪上約 5 ml 溶液 A（參⻅注釋 8）。
4. 1400 g 離⼼ 15-20 分鐘；允許轉(zhuǎn)⼦在沒有制動器的情況下減速（參⻅注釋 5）。
5. 收集在溶液 A 和低密度屏障之間的界⾯處帶狀的細(xì)胞（參⻅圖 2）。

1. 可以使⽤與細(xì)胞相適用的任何培養(yǎng)基。有關(guān)制備溶液的更多信息參考：細(xì)胞應(yīng)⽤手冊 C01。
2. Nycodenz 基礎(chǔ)溶液：配制不含 NaCl 的溶液 A。將 50 毫升該溶液放入 150 毫升燒杯中，置于加熱磁力攪拌器上，溫度設(shè)置為約 50°C，并添加 28.7 g Nycodenz粉末直⾄溶解。讓溶液冷卻⾄室溫，然后⽤溶液 A（去除了 NaCl）定容⾄ 100 ml。如果需要，過濾除菌。⽤溶液 A（完全）稀釋，產(chǎn)⽣與策略 A 或 B 中描述的碘克沙醇溶液濃度相同的溶液。
3. 使⽤能夠提供最佳星狀細(xì)胞回收率和純度的碘克沙醇（或 Nycodenz）濃度。
4. 或者使⽤注射器和⾦屬插管將細(xì)胞懸浮液鋪在溶液 A 下。
5. 使⽤制動器會導(dǎo)致液體中形成渦流并混合內(nèi)容物。
6. 該細(xì)胞層的實(shí)際密度并不是特別關(guān)鍵，只要足夠密即可支持低密度解決⽅案。
7. Brouwer等⼈[2]等⼈描述的兩層法中，將細(xì)胞懸液置于在低密度層。
8. 或者使⽤注射器和⾦屬插管將細(xì)胞懸浮液分層在較低密度的溶液下。

1. Boyum, A., Berg, T. and Blomhoff, R. (1983) Fractionation of mammalian cells In Iodinated density gradient media – a practical approach (ed. Rickwood, D.) IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK, pp 147-171
2. Brouwer, A., Hendricks, H. F. J., Ford, T. and Knook, D. L. (1991) Centrifugation separations of mammalian cells In Preparative centrifugation – a practical approach (ed. Rickwood, D.) IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK, pp 271-314
3. Shek, F. W-T., Benyon, R. C., Walker, F. M., McCrudden, P. R., Pender, S. L. F., Williams, E. J., Johnson, P. A.,Johnson, C. D., Bateman, A. C., Fine, D. R. and Iredale, J. P. (2002) Expression of transforming growth factor-ß1 by pancreatic stellate cells and its implications for matrix secretion and turnover in chronic pancreatitis Am. J. Pathol., 160, 1787-1798
4. Schafer, S., Zerbe, O. and Gressner, A.M. (1987) The synthesis of proteoglycans in fat-storing cells of rat liver Hepatology, 7, 680-687
5. Gressner A.M. and Zerbe, O. (1987) Kupffer cell-mediated induction of synthesis and secretion of proteoglycans by rat liver fat-storing cells in culture J. Hepatol., 5, 299-310
6. Zhang, L.P., Takahara, T., Yata, Y., Furui, K., Jin, B., Kawada, N. and Watanabe, A. (1999) Increased expression of plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor during liver fibrogenesis of rats: role of stellate cells J.Hepatol., 31, 703-711
7. Arias, M., Lahme, B., Van de Leur, E., Gressner, A.M. and Weiskirchen, R. (2002) Adenoviral delivery of an antisense RNA complementary to the 3’ coding sequence of transforming growth factor-ß1 inhibits fibrogenic activities of hepatic stellate cells Cell Growth Differ., 13, 265-273
8. Kurikawa, N., Suga, M., Kuroda, S., Yamada, K. and Ishikawa, H. (2003) An angiotensin II type 1 receptor antagonist,olmesartan medoxomil, improves experimental liver fibrosis by suppression of proliferation and collagen synthesis in activated hepatic stellate cells Br. J. Pharmacol., 139, 1085-1094
9. Yoshiji, H., Kuriyama, S., Noguchi, R., Yoshii, J., Ikenaka, Y., Yanase, K., Namisaki, T., Kitade, M., Yamazaki, M.,Tsujinoue, H. and Fukui, H. (2005) Combination of interferon-ß and angiotensin-converting enzyme inhibitor,perindopril, attenuates the murine liver fibrosis development Liver Int., 25, 153-161
10. Paradis, V. Scoazec, J.W., Kollinger, M., Holstege, A., Moreau, A., Feldmann, G. and Bedossa, P. 1996) Cellular and subcellular localization of acetaldehyde-protein adducts in liver biopsies from alcoholic patients J. Histochem. Cytochem., 44, 1051-1057
11. Nakamura, T., Arii, S., Monden, Z., Furutani, M., Takeda, Y., Imamura, M., Tominaga, M. and Okada, Y. (1998) Expression of the Na+/Ca2+ exchanger emerges in hepatic stellate cells after activation in association with liver fibrosis Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5389-5394
12. Bataller, R., Sancho-Bru, P., Ginès, P., Lora, J.M., Al-Garawi, A., Solé, M., Colmenero, J., Nicolás, J.M., Jiménez, W., Weich, N., Gutiérrez–Ramos, J-C., Arroyo, V. and Rodés, J. (2003) Activated human hepatic stellate cells express the rennin-angiotensin system and synthesize angiotensin II Gastroenterology, 125, 117-125
13. Horani, A. Muhanna, N., Pappo, O., Melhem, A., Alvarez, C.E., Doron, S., Wehbi, W., Dimitrios, K., Friedman, S.L. and Safadi, R. (2007) Beneficial effect of glatiramer acetate (Copaxone) on immune modulation of experimental hepatic fibrosis Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292, G628-G638
14. Shafiei, M.S. and Rockey, D.C. (2006) The role of integrin-linked kinase in liver wound healing J. Biol. Chem., 281, 24863-24872
15. Novosyadlyy, R., Dudas, J., Pannem, R., Ramadori, G. and Scharf, J-G. (2006) Crosstalk between PDGF and IGF-I receptors in rat liver myofibroblasts: implication for liver fibrogenesis Lab. Invest., 86, 710-723
16. Apte, M.V., Haber, P.S., Applegate, T.L., Norton, I.D., McCaughan, G.W., Korsten, M.A., Pirola, R.C. and Wilson, J.S. (1998) Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture Gut, 43, 128-133
17. Masamune, A., Kikuta, K., Satoh, M., Satoh, A. and Shimosegawa, T. (2002) Alcohol activates activator protein-1 and mitogen-activated protein kinases in rat pancreatic stellate cells J. Pharmacol. Exp. Ther., 302, 36-42
18. Phillips, P.A., McCarroll, J.A., Park, S., Wu, M-J., Pirola, R., Korsten, M., Wilson, J.S. and Apte, M.V. (2003) Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover Gut, 52, 275-282
19. Shimizu, K., Shiratori, K., Kobayashi, M. and Kawamata, H. (2004) Troglitazone inhibits the progression of chronic pancreatitis and the profibrogenic activity of pancreatic stellate cells via a PPARy-independent mechanism Pancreas,29, 67-74
20. Jaster, R., Sparmann, G., Emmrich, J. and Liebe, S. (2002) Extracellular signal regulated kinases are key mediators of mitogenic signals in rat pancreatic stellate cells Gut, 51, 579-5844.1027
21. Ohnishi, N., Miyata, T., Ohnishi, H., Yasuda, H., Tamada, K., Ueda, N., Mashima, H. and Sugano, K. (2003) Activin A is an autocrine activator of rat pancreatic stellate cells: potential therapeutic role of follistatin for pancreatic fibrosis Gut, 52, 1487-1493
22. Tanioka, H., Mizushima, T., Shirahige, A., Matsushita, K., Ochi, K., Ichimura, M., Matsumura, N., Shinji, T., Tanimoto, M. and Koide, N. (2006) Xanthine oxidase-derived free radicals directly activate rat pancreatic stellate cells J.Gastroenterol. Hepatol., 21, 537-544
23. Bachem, M.G., Schneider, E., Groß, H., Weidenbach, H., Schmid, R.M., Menke, A., Siech, M., Beger, H., Grunert, A. and Adler, G. (1998) Identification, culture, and characterization of pancreatic stellate cells in rat and humans Gastroenterology, 115, 421-432
24. Peterson, T.C. and Rowden, G. (1998) Drug-metabolizing enzymes in rat liver myofibroblasts Biochem. Pharmacol., 55, 703-708

OptiPrep^TM Application Sheet C27; 第9版，2020年1月（有改動）