人類嗜T淋巴細胞病毒 (HTLV)1型和2型RT- PCR試劑盒說明書
人類嗜 T 淋巴細胞病毒（Human T-cell Lymphoma Virus ，HTLV）屬反轉(zhuǎn)錄病毒，含有 RNA 和反轉(zhuǎn)錄酶，是致瘤性 RNA 病毒，可分為 HTLV1 型和 HTLV2 型。本試劑盒可 在一次反應(yīng)中快速檢測兩種病毒：HTLV1 和 HTLV2 。根據(jù)探針法熒光定量 RT-PCR 原理 開發(fā)，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供核酸（含 DNA 和RNA）模板。
2. 提供兩種病毒的陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
3. 反應(yīng)快速，靈敏度高。
4. 對所有單個病原體的高靈敏度和強特異性。
5. 可用于高通量檢測。
6. 本試劑盒足夠做 25μL 體系的探針法熒光定量 PCR 50 次，只能用于科研。
成分規(guī)格
保存條件 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試 劑。
用自選方法提取純化樣品核酸，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（離心柱型）提取核酸。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，避免污染樣 品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL DEPC-H2O ，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
若有 N 個待檢樣品，準(zhǔn)備 N+2 個 qPCR 管(N 個待檢樣品+1個陰性對照+6 個陽性對 照) ，向各 PCR 管中分別加入下列成分。
轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 2μl 模板，順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣品模板、 HTLV1& HTLV2 雙重 RT-qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進行擴增反應(yīng)。
五、擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進行擴增，擴增程序如下：
熒光基團和猝滅基團選擇如下表：
六、結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA/RNA 濃度的 log 值，推 算出其濃度。
2. 如果無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照結(jié)果：Ct 值<30 ，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。 陰性對照結(jié)果：Ct 值>38 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<35 ，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒，結(jié)果為陽 性；Ct 值>38 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒，結(jié)果為陰性；Ct 值在 35-38 范 圍，應(yīng)對樣本進行復(fù)檢，如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 35~38 范圍，有明顯指數(shù)增長，則 判定為陽性，否則為陰性。
1. 即開即用，用戶只需要提供核酸（含 DNA 和RNA）模板。
2. 提供兩種病毒的陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
3. 反應(yīng)快速，靈敏度高。
4. 對所有單個病原體的高靈敏度和強特異性。
5. 可用于高通量檢測。
6. 本試劑盒足夠做 25μL 體系的探針法熒光定量 PCR 50 次，只能用于科研。
成分規(guī)格
| 產(chǎn)品組成 | 編號 | 規(guī)格 |
| 2 × OneStep Probe Mix | GZ021101a | 650 μl |
| OneStep Probe Enzyme Mix | GZ021102b | 55 μl |
| DEPC-H2O | GZ070403 | 1 ml |
| HTLV1& HTLV2 雙重 RT-qPCR 引物-探針混合液 | GZ02587812yp |
160μl |
| HTLV1& HTLV2 雙重 RT-qPCR 陽性對 照(1×10E8 拷貝/μL) |
GZ02587812pc |
60 μl |
用自選方法提取純化樣品核酸，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（離心柱型）提取核酸。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，避免污染樣 品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL DEPC-H2O ，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
若有 N 個待檢樣品，準(zhǔn)備 N+2 個 qPCR 管(N 個待檢樣品+1個陰性對照+6 個陽性對 照) ，向各 PCR 管中分別加入下列成分。
| 成分 | N 個 待檢樣品管 |
qPCR 陰性對照 | qPCR 陽性對照 |
| 2 × OneStep Probe Mix | 各 12.5 μL | 12.5 μL | 12.5 μL |
| OneStep Probe Enzyme Mix | 各 1 μL | 1 μL | 1 μL |
| HTLV1& HTLV2 雙重 RT-qPCR 引物-探針混合液 | 各 3 μL | 3 μL |
3 μL |
| DEPC-H2O | 各 6.5 μL | 6.5 μL | 6.5 μL |
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 2μl 模板，順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣品模板、 HTLV1& HTLV2 雙重 RT-qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進行擴增反應(yīng)。
五、擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進行擴增，擴增程序如下：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 反轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 15 min |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 3 min |
| qPCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） | 95℃ | 15 sec |
| 60℃ | 20 sec | |
信號通道 |
同時選擇 FAM/Cy5 通道采集熒 光信號 | |
熒光基團和猝滅基團選擇如下表：
| Target | 熒光基團 | 猝滅基團 |
| HTLV1 | FAM | None |
| HTLV2 | Cy5 | None |
六、結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA/RNA 濃度的 log 值，推 算出其濃度。
2. 如果無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照結(jié)果：Ct 值<30 ，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。 陰性對照結(jié)果：Ct 值>38 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<35 ，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒，結(jié)果為陽 性；Ct 值>38 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒，結(jié)果為陰性；Ct 值在 35-38 范 圍，應(yīng)對樣本進行復(fù)檢，如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 35~38 范圍，有明顯指數(shù)增長，則 判定為陽性，否則為陰性。
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