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由來自中山大學(xué)的JiZhou Tan，JiaPing Li以及廣州中醫(yī)藥大學(xué)的YuanQing Zhang等多名研究人員在Acta Pharm Sin B期刊（IF=14.5）上，共同發(fā)表了題為“Anti-PD-L1 antibody enhances curative effect of cryoablation via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity mediating PD-L1highCD11b+ cells elimination in hepatocellular carcinoma”的研究成果，在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的Atezolizumab（M6101）和 Avelumab(M3813)，揭示了 PD-L1 抗體通過誘導(dǎo) NK 細胞的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC）效應(yīng)，從而清除PD-L1highCD11b+細胞的新機制，并為冷凍消融與PD-L1阻斷聯(lián)合應(yīng)用于肝細胞癌的相關(guān)研究提供了依據(jù)。

冷凍消融（CRA）和微波消融（MWA）是肝細胞癌（HCC）的兩種主要研究方法。然而，哪種效果更好且更適合與免疫方法相結(jié)合仍存在爭議。

有研究報道，射頻消融（RFA）會引發(fā)局部炎癥，導(dǎo)致浸潤腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性CD11b+髓系細胞增加，從而阻礙消融術(shù)后免疫研究的效果。研究人員首先收集接受CRA和MWA后的HCC患病受試者的臨床樣本，發(fā)現(xiàn)MWA組PD-L1+CD11b+細胞顯著增加，而CRA組中PD-L1+腫瘤細胞顯著增加（圖1A，B）。隨后研究人員建立BALB/c小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與MVA組相比，CRA組中T細胞浸潤頻率較高，PD-L1highCD11b+細胞較少（圖1C-E），并且腫瘤細胞PD-L1表達上調(diào)，說明CRA在抗PD-L1聯(lián)合應(yīng)用方面可能比MVA更有潛力。

圖 1 A. 消融后第14天，對CRA/MWA患病受試者的腫瘤活檢樣本進行免疫熒光染色。B. 每1 mm2視野中PD-L1+腫瘤細胞和PD-L1+CD11b+細胞的數(shù)量。C-E. CD45+、CD3+T細胞和CD11b+髓系細胞的數(shù)量。

接下來，研究人員在CRA和MWA消融后使用PD-L1抗體（圖2A）處理。H&E染色（圖2D）和總體生存曲線（圖2E）結(jié)果顯示，CRA+抗小鼠PD-L1（CRA+a-PDL1）組的腫瘤體積較其他組明顯縮小（圖2B，C），壞死面積最大且預(yù)后優(yōu)于其他組，說明聯(lián)合應(yīng)用抗PD-L1抗體能提高CRA的效果，并且比聯(lián)合MWA的效果更好。

圖 2 A. 動物實驗示意圖。將H22細胞皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。12天后，進行冷凍消融或微波消融，同時通過尾部注射抗小鼠PD-L1抗體，每3天注射一次，每次10 mg/kg。兩周后，處死所有小鼠。B-C. 6組小鼠的腫瘤重量。D. 腫瘤組織切片的H&E染色。紅線代表腫瘤活區(qū)和壞死區(qū)的邊緣。E. 6組小鼠的存活率。

通過流式細胞術(shù)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)CRA+a-PDL1組CD3+CD8+T細胞的頻率明顯增加，新抗原特異性標(biāo)志物CD39表達升高，IFN-γ分泌增加，抗腫瘤活性更強。免疫熒光圖像顯示，CRA+a-PDL1處理后，CD11c+CD11b-細胞（即cDC1細胞）的頻率增加（圖3E，F(xiàn)），CXLC9增多，同時CD8+T細胞招募也增加（圖3A，B），且CXCL9主要cDC1細胞產(chǎn)生（圖3C，D）。隨后使用動物模型進一步研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗CXCL9能明顯抑制CRA+抗-PD-L1對HCC小鼠模型的效果（圖3G，H），表明抗-PD-L1能通過增強cDC1的CXCL9分泌，從而促進CRA后CD8+T細胞的募集。

圖 3 A. 腫瘤組織切片的免疫熒光染色。B. 6組小鼠中發(fā)現(xiàn)的CD8+T細胞和CXCL9+點在每個視野中的百分比。C-D. 腫瘤微環(huán)境中不同類型細胞門控CXCL9頻率的代表性流式細胞術(shù)分析。E-F. 對腫瘤浸潤的CD45+細胞標(biāo)記的CD11c+CD11b-cDC1細胞進行流式細胞術(shù)定量分析。G-H. 將H22細胞皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。12天后，進行冷凍消融或微波消融，每3天通過尾部注射抗小鼠CXCL9中和抗體（10 mg/kg）或抗小鼠PD-L1抗體（10 mg/kg）。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，a-PDL1組和CRA+a-PDL1組CD49b+NK細胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤增加，抗腫瘤活性提高（圖4A-C）。給小鼠模型注射ADCC阻斷抗體（抗CD16抗體）后，發(fā)現(xiàn)能明顯降低CRA+抗-PDL1聯(lián)合處理的效果（圖4D）。此外，與CRA+anti-PDL1組相比，CRA+anti-PDL1&anti-16組的NK細胞更少，CD11b+髓系細胞的信號也更弱（圖4E），表明CRA和抗PD-L1抗體的聯(lián)合應(yīng)用能通過NK介導(dǎo)的ADCC作用減少PD-L1highCD11b+髓系細胞的數(shù)量，從而改善消融術(shù)后的免疫抑制微環(huán)境。

圖 4 A-B. 流式細胞圖。C.各組CD49b+（NK）和Granzyme B+的流式細胞計數(shù)定量。D. 將H22細胞皮下注射到BALB/c小鼠體內(nèi)。12天后進行冷凍或微波消融，每3天通過尾部注射注入相應(yīng)的抗體。抗小鼠CD16中和抗體的ADCC阻斷試驗。E. 腫瘤組織切片的免疫熒光染色。

最后，通過對比Atezolizumab和 Avelumab兩種抗體的作用效果，發(fā)現(xiàn)具有野生型Fc區(qū)的 Avelumab可以誘導(dǎo)更強的NK介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，從而更好的消除腫瘤浸潤的PD-L1highCD11b+細胞和PD-L1high腫瘤細胞。

該研究使用了購自AbMole的Atezolizumab（M6101）和Avelumab(M3813)兩種PD-L1抗體，Atezolizumab為Fc區(qū)N298A點突變抗體，消除了ADCC效應(yīng)，而野生型Fc區(qū)PD-L1抗體 Avelumab則具有ADCC效應(yīng)。

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，Avelumab對小鼠NK細胞上的CD16有更強的親和力，小鼠WT抗體和 Avelumab能有效偶聯(lián)NK細胞（圖5A）。進一步研究發(fā)現(xiàn)（圖5B），只有 Avelumab能誘導(dǎo)NK介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)。

圖 5 A. 不同抗PD-L1抗體與人源化Fc片段或鼠Fc片段對小鼠NK細胞CD16分子的親和力。B. 從接受CRA處理的HCC小鼠模型中收集殘余腫瘤和自體脾臟。然后分選腫瘤或脾臟中的CD11b+髓系細胞以及腫瘤細胞作為靶細胞。NK細胞首先與CD16和Fc片段結(jié)合抗體孵育30分鐘，然后與靶細胞以2:1的E:T比共培養(yǎng)24小時。以1:1000的比例加入Golgi-stop以停止細胞因子的分泌。

隨后體內(nèi)試驗的結(jié)果顯示，與CRA+Atezolizumab組相比，CRA+ Avelumab組的腫瘤體積更�。▓D6A）。且 Avelumab組CD11b+細胞浸潤區(qū)域出現(xiàn)更多的熒光，表明 Avelumab誘導(dǎo)了髓系細胞的凋亡（圖6B）。并且進一步研究發(fā)現(xiàn)，外周髓系細胞和抗原遞呈細胞的PD-L1表達水平低于PD-L1high的CD11b+細胞，因此應(yīng)用Avelumab誘導(dǎo)的ADCC效應(yīng)不會對腫瘤cDC1細胞和外周循環(huán)中的髓系細胞產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖 6 A. CRA與不同抗體聯(lián)合處理腫瘤小鼠的體內(nèi)實驗。B. 腫瘤組織切片的免疫熒光染色。

綜上所述，該研究表明在體內(nèi)，CRA與PD-L1阻斷聯(lián)合作用的效果優(yōu)于MWA。同時還揭示了抗PD-L1抗體通過增加cDC1細胞分泌CXCL9促進CD8+T細胞浸潤，以及通過ADCC作用增強NK細胞清除PD-L1highCD11b+細胞的新機制。此外，研究結(jié)果表明野生型PD-L1抗體Avelumab比突變型Atezolizumab更能誘導(dǎo)針對PD-L1highCD11b+細胞的ADCC效應(yīng)。該研究為阻斷PD-L1聯(lián)合CRA攻克HCC提供了一種新策略。

鳴謝：Tan J, Liu T, Fan W, et al. Acta Pharm Sin B. 2023;13(2):632-647.