SpheroONE自動化3D球體分選技術(shù)助力藥物篩選

瀏覽次數(shù)：722　發(fā)布日期：2024-7-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

CELLENION自動化3D球體分揀、分離和分選

「摘要」
spheroONE®是一種獨(dú)特的大顆粒分離、分選和噴點(diǎn)儀器。該儀器結(jié)合了精密的低容量噴點(diǎn)、基于圖像的玻璃噴點(diǎn)毛細(xì)管內(nèi)顆粒跟蹤和自動化功能,能夠高效地分離和分揀球體、類器官和類腫瘤體等細(xì)胞聚集體。分離過程通�？稍跀�(shù)分鐘內(nèi)將 92% 以上的單個球形顆粒分配到目標(biāo) 96 孔板的每個孔中。此外,用戶還可以隨時定義分離參數(shù)（即顆粒的直徑和伸長率),從而根據(jù)細(xì)胞聚集體的形態(tài)對不同亞群的細(xì)胞聚集體進(jìn)行分揀。spheroONE® 為3D細(xì)胞模型標(biāo)準(zhǔn)化和自動化處理提供了前所未有的手段。

「簡介」
3D球體因其固有的臨床相關(guān)性而在高通量篩選中獲得了極大的關(guān)注（Nunes,2018）。這與實(shí)體腫瘤建模尤其相關(guān),因為3D球體具有空間結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散障礙、差異基因表達(dá)和耐藥性等特征,使其成為抗腫瘤藥物篩選的首選模型（Costa,2016）。為了進(jìn)行可重復(fù)的檢測,根據(jù)球體的大小、形態(tài)和內(nèi)部組織預(yù)選球體至關(guān)重要。迄今為止,還沒有可行的方法來分離和操縱細(xì)胞聚集體（Singhera,2017 年）。通過融合關(guān)鍵技術(shù),即精確的納升體積按需點(diǎn)滴、機(jī)器人技術(shù)、成像和軟件自動化，Cellenion 開發(fā)出了用于分揀、分離和點(diǎn)滴3D球體、類器官和類腫瘤體等大顆粒的創(chuàng)新平臺--SpheroONE®。本文通過展示我們從異質(zhì)群體中分離出顯示用戶定義尺寸和形態(tài)特征的球狀體的能力,突出了該平臺的功能。

「材料與方法」
自動大顆粒分離和噴點(diǎn)
在以下實(shí)驗中使用了一臺配備精密納升體積按需滴定系統(tǒng)（Nano Dispense Capillaries,NDC,約Ø = 400 µm）、光學(xué)系統(tǒng)（包括高分辨率相機(jī)、暗場照明模塊）、x-y-z軸系統(tǒng)和專用軟件的spheroONE®儀器。

細(xì)胞培養(yǎng)
HEK 細(xì)胞在添加 10% FBS 和抗生素（青霉素/鏈霉素）的 DMEM 中培養(yǎng)。HEK 球形細(xì)胞是在超低附著力（ULA）燒瓶（Nunclon sphera,Thermo Fisher）中通過液體覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)制備的,培養(yǎng)過程恒定攪拌（100-150 轉(zhuǎn)/分）3-7 天。培養(yǎng)基每隔一天更換一次。

樣品制備
樣品（3 毫升）含有 PBS 溶液中的球體懸浮液（500-1500 個球體/毫升）,在吸收前對其進(jìn)行過濾（Uberstrain,70 µm),以去除細(xì)小的細(xì)胞碎片。在無菌條件下,將濾過的樣品裝入專用的加壓樣品容器中,然后轉(zhuǎn)移到spheroONE® 中進(jìn)行處理。

活/死檢測
分離和分配后4小時,通過熒光成像和分析使用 Hoechst33342和碘化丙啶（PI）染色的球體分析來評估細(xì)胞活力。

結(jié)果與討論
單球體分離
分離過程示意圖見圖1。在隔離之前,為確保精確隔離,NDC 被放置在儀器的攝像頭前,并執(zhí)行自動mapping程序。mapping程序（在連續(xù)分配液滴的同時，對NDC內(nèi)部多達(dá)100個物體進(jìn)行約100次跟蹤）可精確確定噴射區(qū)（圖1a）,該區(qū)域與下一個待分配液滴的體積所填充的區(qū)域相對應(yīng)。為了考慮到在軸運(yùn)動過程中，噴點(diǎn)毛細(xì)管內(nèi)的顆�？赡軙l(fā)生沉淀,軟件設(shè)置了一個沉淀區(qū)（圖 1a）。mapping完成后,SpheroONE® 執(zhí)行的分離過程如下（圖 1b）：(i) 將毛細(xì)管置于攝像頭前,(ii) 在制作下一個液滴之前采集圖像、(iii)對圖像進(jìn)行處理和分析,(iv)軟件自動確定下一個液滴是否含有符合用戶定義的分離參數(shù)的單個球體（在這種情況下,軸系統(tǒng)將 NDC 移到下一個目標(biāo)孔上方以分配包含球體的液滴然后返回相機(jī)前）,或者不含有球體（在這種情況下,液滴直接分配到回收管中）

圖1

分離過程。a. 納米噴點(diǎn)毛細(xì)管圖像及噴射區(qū)和沉淀區(qū)示意圖。b. 分離過程示意圖。分離情況：在噴射區(qū)檢測到單個顆粒,沉淀區(qū)無顆粒。丟棄情況:在噴射區(qū)未檢測到顆粒（左）或在噴射區(qū)檢測到多個顆粒（中）,且在沉積區(qū)檢測到顆粒（右）。
c. 在暗場照明下NDC中細(xì)胞聚集體（白色箭頭)的
spheroONE®圖像。

為說明分離過程，將HEK球體懸浮液（每毫升PBS中含有500-1500個球體）加載到spheroONE®（圖 2a）。樣品儲存器被加壓（約200 mBar）,并使用專用程序任務(wù)進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)處理，以確保管道中充滿溶液且無任何氣泡。設(shè)置檢測和分離參數(shù)，并執(zhí)行mapping以確定噴射區(qū)。將一個預(yù)裝了50µL培養(yǎng)基的96U型底孔板放在目標(biāo)板支架上。開始分離運(yùn)行，在目標(biāo)孔板的每個孔中分離和分配單個球體（圖2b）。通過設(shè)置定義的大小和伸長參數(shù)，可對子群體進(jìn)行排序（圖 2c）。

圖2

球體分離。a. 分選和分離前球狀體懸浮液的顯微圖像。
b. 分離到單個孔中的球體拼接圖像。
c. 分離球體（粉紅色點(diǎn)）和排除球體（藍(lán)色點(diǎn)）的大�。ㄖ睆剑┖托螤睿ɡ欤┑膱D形表示。（比例尺 = 500µm）。

分離過程具有很高的可重復(fù)性,這一點(diǎn)可以從四次獨(dú)立分離運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)的分離準(zhǔn)確性看出（圖 3）。

平均而言,單個球體的準(zhǔn)確率達(dá)到 91%（CV < 2%）。

圖3

按大小對球體進(jìn)行分類
為了進(jìn)一步說明SpheroONE®按大小分離球體的能力,我們使用不同的分離參數(shù)進(jìn)行了多次額外的運(yùn)行。在第一次分離運(yùn)行中,分離出直徑為100-500 微米的球體。第二次運(yùn)行使用的參數(shù)稍窄,分離出直徑為 350-500 微米的最大球體。第三次運(yùn)行分離出直徑為 200-250 微米的較小球體。
分離后,使用明場視野顯微鏡對球體進(jìn)行成像,并根據(jù)這些圖像測量其平均直徑。不出所料,第一次分離得到了高度異質(zhì)的單個球體,測量直徑從160微米到 669 微米不等（圖 4a、d）。第二次運(yùn)行成功分離出直徑為277至550微米的最大球體（圖 4b、d）。第三次實(shí)驗分離出高度均勻的球體,直徑從151微米到 238微米不等（圖 4c、d）。顯微鏡測量的直徑與SpheroONE®暗場視野圖像之間存在差異的原因是由于光擴(kuò)散在球體外緣形成光暈,使用暗視野照明時對球體直徑產(chǎn)生高估。

圖4

按大小排序的球體。a. 排列好的球體的顯微圖像，直徑范圍為100-500微米。b. 排列好的球體的顯微圖像，直徑范圍為350-500微米。c. 排列好的球體的顯微圖像，直徑范圍為200-250微米。d. 排列好的球體的大小分布的圖示。測量是通過使用默認(rèn)的分割工具從顯微圖像中進(jìn)行的。（比例尺 = 500微米）。

分離后的細(xì)胞活性
為了評估spheroONE®分離后類球體的活性，在分離后4小時進(jìn)行了活/死染色（圖5）。分離和分裝并未損害細(xì)胞聚集體的完整性及其活性（圖5）。總體而言，細(xì)胞存活率超過 97%（圖5b）

圖5

分離后球體的存活率。
a. 分離球體的顯微鏡圖像，用Hoechst和PI染色。
b. 分離球體在分配后4小時的存活率圖示。分析顯示分離后存活率超過98%。（比例尺 = 500 µm）

結(jié)論與未來的方向
研究結(jié)果表明,SpheroONE® 平臺能夠高精度地重復(fù)分離單個球體（每孔單個球體高達(dá) 92%）,并根據(jù)用戶定義的特征（大小和形狀）對其進(jìn)行分揀。通過使用生存率測定驗證了分離后球體的完整性,證明了spheroONE®技術(shù)在分選和分離過程中沒有損壞這些細(xì)胞聚集體或其中的細(xì)胞。這些能力展示了該儀器成為推動建立標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)雜體外3D模型的潛在技術(shù)的可能性,這將極大地加速藥物發(fā)現(xiàn),并最終減少或取代一些動物實(shí)驗。

索取資料

來源：Scienion GmbH
聯(lián)系電話：18621709292
E-mail：n.sun@scienion.com

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