RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應實驗要素解說
RT-PCR 就是逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。RT-PCR原理是提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
在 RT-PCR 中，一條 RNA 鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補 DNA，再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù) qPCR 實驗�；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實驗需求可進行相應引物的選擇。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無 gDNA 和蛋白殘留。
