和細(xì)胞第一次見(jiàn)面的時(shí)候我們要做好什么準(zhǔn)備呢？快跟著小M 一起看看吧~

▐  01 記錄細(xì)胞重要信息

當(dāng)?shù)谝淮卧趯?shí)驗(yàn)室接收細(xì)胞系時(shí)，有幾條與細(xì)胞系有關(guān)的信息應(yīng)該被整理和記錄，這些將確保細(xì)胞系的成功繁殖、擴(kuò)增、冷凍保存和儲(chǔ)存。小 M 強(qiáng)烈建議在細(xì)胞擴(kuò)增開(kāi)始之前記錄以下信息：(1) 背景信息，(2) 傳代培養(yǎng)，(3) 冷凍保存，(4) 細(xì)胞系儲(chǔ)存。

表 1. 需要記錄與細(xì)胞系有關(guān)的信息^[1]。

 

注意：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，連續(xù)細(xì)胞系在培養(yǎng)中會(huì)發(fā)生變化。然而，許多研究已經(jīng)證明了長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞系形態(tài)、發(fā)育和基因表達(dá)的各種影響：如細(xì)胞生長(zhǎng)變異，導(dǎo)致細(xì)胞污染等。因此，當(dāng)?shù)谝淮螌⒓?xì)胞系接收到實(shí)驗(yàn)室時(shí)，留有低傳代的細(xì)胞種子庫(kù)是非常重要的。▐  02 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察監(jiān)測(cè)和記錄細(xì)胞形態(tài)和行為是十分重要的，推薦做法是在傳代培養(yǎng)之前定期仔細(xì)地檢查培養(yǎng)細(xì)胞，以確定其狀態(tài)和健康狀況。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果可以幫助“科研汪”們判斷 (1) 細(xì)胞的形態(tài)：健康 or 惡化 (即衰老或壞死的細(xì)胞)？(2) 是否存在細(xì)胞污染？(3) 區(qū)分細(xì)胞及細(xì)胞密度。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)為：懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。然而，在某些情況下可能會(huì)觀察到懸浮和貼壁的混合群體。  

培養(yǎng)中的動(dòng)物細(xì)胞的形狀可分為三個(gè)基本形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣(Fibroblast-like)、上皮細(xì)胞樣(Epithelial-like) 和類(lèi)淋巴母細(xì)胞樣(Lymphoblastoid-like)。

圖 1. 培養(yǎng)細(xì)胞的一般特征和形狀^[1]。

(A) 上皮樣 (貼壁)；(B) 成纖維細(xì)胞樣 (貼壁)；(C) 淋巴母細(xì)胞樣 (懸浮液)。

 

(以收到 T25 培養(yǎng)瓶為例)

1. 先觀察培養(yǎng)基顏色以及是否有漏液情況，再在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照，排除細(xì)胞本身污染或狀態(tài)不好的情況；

2. 確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)正常后將細(xì)胞瓶外壁消毒，放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(shí) (根據(jù)細(xì)胞密度定) 以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)；

3.1 貼壁細(xì)胞：細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò) 80% 時(shí)，可根據(jù)情況傳代，若細(xì)胞未超過(guò)80%匯合度時(shí)，可對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行半換液處理，即吸去一半的原培養(yǎng)基 (不要丟掉可以留給細(xì)胞過(guò)渡用)，再加入等量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度超過(guò) 80% 以后再進(jìn)行傳代；

3.2 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體轉(zhuǎn)移至離心管，500 g 離心 5 min，溫柔的倒出上清液 (也可以先保留下來(lái)以備不時(shí)之需)，管底細(xì)胞沉淀加入 10 mL 完全培養(yǎng)基吹打、重懸。放入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜，根據(jù)細(xì)胞密度及生長(zhǎng)情況分瓶傳代。

圖 2. 臺(tái)盼藍(lán)染色圖^[2]。

4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)：無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到 200-2000 個(gè)/毫升，在 10-100 µl 的細(xì)胞懸液中加入等體積的 0.4% 的臺(tái)盼藍(lán)溶液。輕輕混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼藍(lán)，依舊是透亮的狀態(tài)，死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)更方便哦~

選擇合適的培養(yǎng)基對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要，不同類(lèi)型的細(xì)胞具有不同的生長(zhǎng)需求和特定的培養(yǎng)條件。首先，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是維持細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所必需的。不同類(lèi)型的細(xì)胞需要各種不同的氨基酸、糖類(lèi)、維生素、無(wú)機(jī)鹽和脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿(mǎn)足其生理需求。如果培養(yǎng)基中缺乏必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞可能無(wú)法正常生長(zhǎng)和分裂，甚至?xí)��?dǎo)致細(xì)胞死亡[3][4]。選擇合適的培養(yǎng)基的時(shí)候優(yōu)先根據(jù)細(xì)胞來(lái)源公司提供的培養(yǎng)條件，無(wú)法確定來(lái)源的可以參考 ATCC 推薦細(xì)胞對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基。表 2. 常見(jiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)體系。

其次，不同類(lèi)型的細(xì)胞需要特定的生長(zhǎng)因子和激素來(lái)維持其特定的功能和特性。例如，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中通常添加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 ，以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和突觸形成；胎牛血清 通常被添加到培養(yǎng)基中，提供細(xì)胞所需的生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)和其他重要組分。

此外，必要時(shí)候也可以加入抗生素來(lái)防止污染保衛(wèi)細(xì)胞。例如雙抗 (青霉素/鏈霉) 甚至三抗 (青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B) 以抑制細(xì)菌和真菌等微生物的生長(zhǎng)，青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌 和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。

 

隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞的數(shù)量會(huì)增加，而空間和資源卻有限。所以，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定密度時(shí)，就該考慮給他們一個(gè)更廣闊的居住空間，讓他們繼續(xù)昌盛繁衍。

圖 3. 傳代流程圖。

常見(jiàn)的細(xì)胞傳代步驟參考如下：

(以 T25 培養(yǎng)瓶為例)

1. 從培育箱中取出細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，匯合度大于 80% 即可傳代；

2. 準(zhǔn)備操作：培養(yǎng)基和 PBS 放置 37℃ 水浴鍋預(yù)熱，將傳代所用耗材(移液管、移液槍、T25 培養(yǎng)瓶、槍頭等) 放入超凈工作臺(tái)，紫外滅菌 30 min 后通風(fēng)，將胰酶和預(yù)熱后的培養(yǎng)基以及 PBS 用 75% 酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；

3. 吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，5 mL PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞，吸棄 PBS；

4. 加入 1 mL 胰蛋白酶，輕晃培養(yǎng)瓶使胰蛋白酶充分覆蓋細(xì)胞，放入 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 30 s-2 min (實(shí)際孵育時(shí)間因所使用的細(xì)胞系而異)；

5. 顯微鏡下觀察，當(dāng) ≥90% 的細(xì)胞脫落時(shí)，加入兩倍胰酶體積的含血清的完全培養(yǎng)基，終止消化，吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使其分散成單個(gè)細(xì)胞；

6. 500× g 離心 3-5 分鐘，將細(xì)胞沉淀重懸于含血清的完全培養(yǎng)基；

7. 將細(xì)胞懸液按傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充新鮮完全培養(yǎng)基，輕晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記；

8. 顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及狀態(tài)，把細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。

注意：利用胰蛋白酶進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要考慮許多因素。胰蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)的活性，可影響細(xì)胞的多種生理代謝功能。

 

Tips：胰蛋白酶?jìng)鞔�培養(yǎng)細(xì)胞的最佳方法

• 在添加胰蛋白酶之前，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的生理鹽水/PBS 清洗，以去除這些離子 (溶液中的 Ca2+、Mg2+ 和血清會(huì)降低胰酶活力)；

• 用最低濃度和體積的胰蛋白酶從培養(yǎng)瓶表面去除細(xì)胞；

• 如果可能的話(huà)，在室溫或更低的溫度下使用胰蛋白酶溶液，以減少酶的內(nèi)吞作用；

• 盡可能短的時(shí)間使用胰蛋白酶處理細(xì)胞，避免消化過(guò)度影響細(xì)胞；

• 用胰蛋白酶抑制劑如含血清或血清的完全培養(yǎng)基中和終止胰蛋白酶活性，然后用離心除去胰蛋白酶；

• 細(xì)胞脫落后立即離心除去培養(yǎng)瓶表面的胰蛋白酶。

細(xì)胞凍存就像是給細(xì)胞一個(gè)冰凍的時(shí)間旅行機(jī)票，保證它們?cè)谖磥?lái)可以“解凍”回到活力四溢的狀態(tài)。這一過(guò)程可以確保你的珍貴細(xì)胞庫(kù)不會(huì)因?yàn)闀r(shí)間的推移而遭受損失。

那么凍存細(xì)胞的最佳時(shí)機(jī)是什么時(shí)候？什么樣的細(xì)胞濃度合適？要用多少凍存液呢？怎么實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的“慢凍”？復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒(méi)有活？好不容易復(fù)蘇的細(xì)胞竟然污染了？怎么才能讓細(xì)胞滿(mǎn)血復(fù)活呢？

關(guān)于這些問(wèn)題小 M 在往期推文中已經(jīng)為大家整理過(guò)了，本期不再贅述。詳情可見(jiàn)往期推文：干貨分享 | 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇避坑指南 ( 不看后悔 !!!）

今天小 M 和您的細(xì)胞之旅就到這里啦，我們下次見(jiàn)~

 

Fetal Bovine Serum (FBS)特級(jí)胎牛血清，烏拉圭

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

DMEM (Low Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

RPMI 1640 (L-Glutamine, Phenol Red, no HEPES)細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

BM-Cyclin 支原體清除試劑有效抑制和清除在細(xì)胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染

Penicillin-Streptomycin雙抗，可以對(duì)許多細(xì)菌引起的污染進(jìn)行有效的控制

0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red用于細(xì)胞解離、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)傳代及原代組織解離，使組織或貼壁細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞

[1] Reid YA. Best practices for naming, receiving, and managing cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 Oct;53(9):761-774.

[2] Aung S M, et al. Live and dead cells counting from microscopic trypan blue staining images using thresholding and morphological operation techniques[J]. International Journal of Electrical and Computer Engineering, 2019, 9(4): 2460.

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