PCR引物設(shè)計的原則歸納和詳細介紹
PCR引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。要設(shè)計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應(yīng)預(yù)測將要擴增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥壗Y(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物。
現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。
同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計原則：
①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。
②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。
③引物長度一般在15~30堿基之間。
④G+C含量在40%~60%之間。
⑤堿基要隨機分布。
⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑧引物5′端可以修飾。
⑨引物3′端不可修飾。
⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。
PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。
1. 引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。
2. 避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6 lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
3. 長度
寡核苷酸引物長度為15~30 bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。
4. G+C含量
G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
5. 堿基礎(chǔ)隨機分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
6. 引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。
7. 引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
8. 引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。
9. 引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10. 密碼子的簡并
如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。
現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計引物。
同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的互補。引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計原則：
①引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。
②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。
③引物長度一般在15~30堿基之間。
④G+C含量在40%~60%之間。
⑤堿基要隨機分布。
⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑧引物5′端可以修飾。
⑨引物3′端不可修飾。
⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。
PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。
1. 引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。
2. 避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6 lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
3. 長度
寡核苷酸引物長度為15~30 bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。
4. G+C含量
G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
5. 堿基礎(chǔ)隨機分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
6. 引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。
7. 引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補性，尤應(yīng)避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。
8. 引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。
9. 引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10. 密碼子的簡并
如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。
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