使用spheroONE制備HepaRGTM球形體進(jìn)行檢測的準(zhǔn)備工作

# 摘要
分化的HepaRGTM細(xì)胞是獨(dú)特的人類雙能細(xì)胞，能夠形成類似膽道和類似肝細(xì)胞的細(xì)胞。它們表達(dá)多種解毒酶，廣泛用于早期藥物發(fā)現(xiàn)中的肝毒性檢測。在這項(xiàng)研究中,我們展示了高通量和高效形成高功能性的HepaRGTM球體細(xì)胞,它們通過spheroONE的分選和分離,以獲得每孔含有均勻的單個(gè)HepaRGTM球體的檢測就緒板。

# 介紹 近年來，3D細(xì)胞模型如球體和類器官的應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，因?yàn)樗鼈冎匦履�擬了傳統(tǒng)單層細(xì)胞培養(yǎng)中缺乏的空間結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散屏障、差異基因表達(dá)等特征 [1]。

在3D細(xì)胞模型的領(lǐng)域中，HepaRGTM人肝細(xì)胞系已證明了其在研究肝毒性方面的價(jià)值，其代謝特性使其成為抗腫瘤藥物篩選的首選模型[2],[3]。藥物篩選必須在根據(jù)大小和形態(tài)選擇的球體上進(jìn)行，這意味著球體必須根據(jù)某些預(yù)選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類和分離。Cellenion 

開發(fā)了一種創(chuàng)新平臺(tái)--SpheroONE，用于從大量細(xì)胞聚集體中分揀、分離和分配大顆粒(如球體和類器官)。

# 材料與方法 
球形體大批量生產(chǎn)

培養(yǎng)基制備:
將冷凍的含抗生素的HepaRGTM預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（ADD610，Biopredic International 公司）

置于 37°C 水浴中直至完全解凍。將解凍的 ADD610 補(bǔ)充劑加入100mL基礎(chǔ)肝細(xì)胞培養(yǎng)基（MIL600，Biopredic International 公司）中,重新配制HepaRGTM 誘導(dǎo)前培養(yǎng)基,命名為 MIL610。

將冷凍的含抗生素的 HepaRGTM 維護(hù)/代謝培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（ADD620，Biopredic International 公司）置于 37°C 水浴中直至完全解凍。將解凍的 ADD620 補(bǔ)充劑加入100mL基礎(chǔ)肝細(xì)胞培養(yǎng)基（MIL600，Biopredic International 公司）中,重新配制HepaRGTM維護(hù)/代謝培養(yǎng)基,命名為 MIL620。

細(xì)胞播種和類球體形成：
7孔的微腔Elplasia板P24（康寧，型號(hào)：4441，每孔包含554個(gè)微腔）預(yù)先填充了1mL在37°C水浴中預(yù)熱的MIL610。為了平均每個(gè)類球體獲得2000個(gè)HepaRGTM細(xì)胞，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至1.11x106細(xì)胞/mL的MIL610。將此細(xì)胞懸液（1mL/孔）播種到每個(gè)預(yù)先填充了培養(yǎng)基的孔中，并將板在37°C、5% CO2條件下孵育4天以形成類球體。

樣品制備:
在各腔中形成 HepaRGTM 球形體后，將球狀體從Elplasia板轉(zhuǎn)移到15 mL的Falcon管中。移除培養(yǎng)基，并將球狀體重懸于6 mL無菌PBS（含Ca2+和Mg2+,Corning,參考編號(hào):21-030-CM）中。樣品的前半部分在無菌條件下裝入3 mL的spheroONE樣品儲(chǔ)存器中，并安裝到spheroONE中開始分選和分離。完全處理后，將剩余的樣品裝入儲(chǔ)存器并安裝到spheroONE中進(jìn)行第二輪球狀體分選和分離。

球狀體分選與分離:
spheroONE是一種用于大規(guī)模細(xì)胞聚集體的分選和分離的創(chuàng)新設(shè)備。利用精密噴點(diǎn)技術(shù)和先進(jìn)的基于圖像的分選能功能，spheroONE可以選擇和分離球狀體、類器官和類腫瘤體。在以下實(shí)驗(yàn)中使用了納米噴點(diǎn)毛細(xì)管（NDC，直徑約為300 µm）。

樣品儲(chǔ)存器被加壓（150 mBar）,并設(shè)置了檢測和分離參數(shù)，以分離直徑在200 µm到250 µm之間的球狀體。

四個(gè)384孔ULA板（Corning，參考編號(hào)：4516）預(yù)先填充了30 µL的MIL620。根據(jù)spheroONE上預(yù)先選擇的參數(shù)，每孔分離出一個(gè)單一的球狀體。

分離后的類球體形態(tài):
通過顯微鏡（Axio observer Z1，5倍物鏡，Zeiss）在分離后2天評(píng)估球體形態(tài)。使用Zen軟件工具（Zeiss）測量球體直徑。

球體功能性:
在分離球狀體后培養(yǎng)2天后，進(jìn)行了系列的生存率和功能性測試。

使用 ATP 評(píng)估類球蛋白酶活力:
使用CellTiter-Glo®3D細(xì)胞活力檢測試劑盒（Promega，參考文獻(xiàn)：G9682）評(píng)估球體的活力。該實(shí)驗(yàn)按照生產(chǎn)商的協(xié)議在一個(gè)平底96孔板中對(duì)10個(gè)隨機(jī)選擇的球體進(jìn)行檢測。使用微孔板掃描儀（FLUOstar Omega Multimode，BMG LABTECH）測量發(fā)光度。

使用生死染色法檢測球體的活力:
使用Hoechst 33342(5 µg/mL)和溴化乙錠（EtBr）（1 µg/mL）評(píng)估球體的活力。球體在30°C的黑暗環(huán)境中孵育5分鐘，然后用PBS清洗3次。染色后的球體被轉(zhuǎn)移到平底384孔板的孔中，隨后使用熒光顯微鏡（Axio observer Z1，Zeiss）進(jìn)行成像和分析。

白蛋白分泌:
為了獲得足夠的體積進(jìn)行此檢測，每次測量時(shí)，從包含384孔ULA板的球體的10個(gè)隨機(jī)選擇孔中取10 µL上清液并混合在一起。然后根據(jù)生產(chǎn)商的協(xié)議，使用商業(yè)化的人類蛋白ELISA試劑盒（Bethyl Laboratories，參考文獻(xiàn):E88-129）測量白蛋白的分泌。使用微孔板掃描儀（FLUOstar Omega Multimode, BMG LABTECH）測量吸光度�？偣策M(jìn)行了3次測量。

結(jié)論討論
大批量球狀細(xì)胞的制備:
在P24Elplasia板中接種并培養(yǎng)4天后,分化的HepaRGTM細(xì)胞形成了緊密聚集的HepaRGTM球體。通過顯微鏡及其相關(guān)軟件確定,形成的HepaRGTM球體在大小上是異質(zhì)的，直徑范圍大約在150到350微米之間。

球體分離:
在HepaRGTM球體形成后，成功地利用spheroONE進(jìn)行匯集和處理，以獲得每個(gè)孔中直徑為200到250微米的單個(gè)分選球體，這些孔位于4個(gè)U形底部ULA 384孔板中。在球體分離后，板子在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)。經(jīng)過2天培養(yǎng)后，對(duì)平板進(jìn)行成像，記錄每孔的單張圖像（圖1）。 

圖1:5x5的顯微鏡平鋪圖,展示了在U底ULA 384孔板中分化的HepaRGTM球體。5倍物鏡,球體直徑:200-250µm。比例尺 = 200µm。

從獲取的圖像中，使用分割工具（Zen Software, Zeiss）測量了100個(gè)球體的直徑。根據(jù)這些測量數(shù)據(jù)，生成了盒裝圖（圖2）,顯示球體的平均直徑及其大小分布。
 

圖2:SpheroONE 分離后培養(yǎng)2天的HepaRGTM 球體直徑方框圖。

這些顯微鏡圖像和直徑測量結(jié)果證實(shí),所有通過spheroONE分離的HepaRGTM球形體的直徑范圍在200到249微米之間，平均值為226微米。 

球體形態(tài):
對(duì)這些顯微鏡圖像的進(jìn)一步目視檢查表明，spheroONE并沒有損害球狀體的完整性，所有分離的球狀體都緊密排列且均勻（圖3）。

圖3:在 spheroONE分離后培養(yǎng)2天的U底 ULA384孔板中的分化 HepaRGTM球體的顯微鏡圖像。物鏡 x5。比例尺 200µm。

球狀體功能:
使用ATP評(píng)估球狀體的活力
根據(jù)發(fā)光讀數(shù),可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)球狀體產(chǎn)生的ATP量。結(jié)果顯示出良好的重復(fù)性,每個(gè)球狀體產(chǎn)生的ATP在962到1123 nM之間,平均值為1032 +/-23 nM。這個(gè)值與Biopredic International的內(nèi)部質(zhì)量控制數(shù)據(jù)一致（由2000個(gè)HepaRGTM細(xì)胞組成的球狀體在ULA 96孔板（Corning Costar®, Ref: 7007）中使用MIL620培養(yǎng)，ATP含量在558到1156 nM之間）,表明形成的HepaRGTM球狀體顯示出良好的活力和能量狀態(tài)。

使用活死染色法檢測球體細(xì)胞活力
此外，使用“活死”染色法對(duì)一些孤立的球體進(jìn)行了染色，將其轉(zhuǎn)移到平底384孔板中，隨后在熒光顯微鏡下進(jìn)行成像，以確定這些球體中是否存在死亡細(xì)胞。 
 

圖4:在平底384孔板中的分化HepaRGTM球體顯微鏡圖像,在spheroONE分離后培養(yǎng)2天,并進(jìn)行了活-死染色。物鏡x10。比例尺100µm。藍(lán)色染色=存活細(xì)胞。紅色染色=死亡細(xì)胞。

幾乎所有的細(xì)胞在球狀體中都是活的（大多數(shù)為藍(lán)色且沒有紅色）,在spheroONE分離后,這些球狀體中僅觀察到極少數(shù)的死細(xì)胞（紅色)（圖4）。

這兩種檢測方法均確認(rèn):
HepaRGTM球狀體在使用spheroONE進(jìn)行分類和分離后，既沒有受損，其細(xì)胞活力也未受到影響。

白蛋白分泌:
通過吸光度測量和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出每組10孔的分泌白蛋白濃度。3次測量的結(jié)果顯示類器官分泌的白蛋白濃度在49到62 ng/mL之間，平均值為55 +/- 4 ng/mL。這個(gè)值與之前發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示的值一致,表明形成的HepaRGTM類器官表現(xiàn)出良好的功能性。

ATP活力和白蛋白劑量都與Biopredic International在HepaRGTM3D細(xì)胞模型質(zhì)量控制評(píng)估期間獲得的標(biāo)準(zhǔn)值一致，這確認(rèn)了通過spheroONE分離的HepaRGTM類器官具有良好的功能。

這些實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了通過spheroONE分選和分離能力成功制備了高度均勻的U底ULA 384孔板，每孔填充一個(gè)緊密包裝、有活力和功能性的單個(gè)HepaRGTM類器官。

結(jié)論
在這項(xiàng)研究中，我們展示了如何通過自組裝輕松準(zhǔn)備大量功能性的HepaRGTM肝類球。這些肝類球是使用現(xiàn)成的分化HepaRGTM細(xì)胞（來自Biopredic International的HPR116）播種在超低粘附微結(jié)構(gòu)化Elplasia®微孔板中制備的。隨后，這些大量的HepaRGTM類球通過spheroONE進(jìn)行大小分選和分離，以獲得高度均一的現(xiàn)成檢測板，每孔包含一個(gè)類球細(xì)胞。功能和存活率檢測表明，即用型檢測板中的HepaRGTM 球形體在性能上與使用更費(fèi)力的手工方法制成的球形體相當(dāng)�？傮w而言，結(jié)合HPR116細(xì)胞和spheroONE進(jìn)行高通量和自動(dòng)化的方式制備有功能性HepaRGTM球形體的現(xiàn)成檢測板，非常適用于在藥物發(fā)現(xiàn)的不同階段廣泛實(shí)施的各種3D肝模型篩選應(yīng)用。

致謝：
分化的HepaRGTM細(xì)胞和培養(yǎng)試劑由
Biopredic International提供給Cellenion。

參考文獻(xiàn):
[1] Fang, Y., & Eglen, R. M. (2017). Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discovery, 22(5), 456-472.
[2] Ferreira, A., Rodrigues, M., Silvestre, S., Falcão, A., & Alves, G. (2014). HepaRG cell line as an in vitro model for screening drug–drug interactions mediated by metabolic induction: Amiodarone used as a model substance. Toxicology in Vitro, 28(8), 1531-1535.
[3] Andersson, T. B., Kanebratt, K. P., & Kenna, J. G. (2012). The HepaRG cell line: A unique in vitro tool for understanding drug metabolism and toxicology in human. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 8(7), 909-920.