碘化丙啶在細胞活性研究PI染色中的應用和常見問題
碘化丙啶（Propidium iodide）是一個小分子芳香化合物，通常在研究和開發(fā)中作為熒光核酸結(jié)合染料。PI通常用于區(qū)分活細胞與凋亡細胞和壞死細胞,因為它可以自由滲透死亡或損傷細胞膜,而不能進入正�；罴毎５饣つ苋旧怂�，如DNA和RNA，因此可用作流式細胞儀、原位雜交和免疫組織化學應用中細胞膜完整性的指示劑。
在樣品中加入碘化丙啶后，細胞膜永久性或可逆性損傷的細胞將發(fā)出紅色熒光。通過這種方式，碘化丙啶能夠快速且可靠地識別和定量死亡和壞死細胞。碘化丙啶有助于確定整體細胞活性，這是用于監(jiān)測細胞群體對細胞毒性藥物或其他環(huán)境因素的反應的重要參數(shù)。
活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配細胞凋亡標記染料（如Annexin V-FITC或發(fā)出明亮綠色熒光的iFluor® 488）。當一起使用時，可以獲得總細胞計數(shù)，并且可以觀察樣本中的細胞形態(tài)。例如，使用這兩種染色劑可以區(qū)分完整細胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡細胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（iFluor® 488+PI+）。
碘化丙啶的化學結(jié)構(gòu)
PI染色方案
用PI染色細胞的基本方法如下:
1. 細胞準備：將PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA緩沖液等緩沖溶液中。染色溶液中PI的濃度可能因?qū)嶒灄l件而異，但通常為1-5mg/ml。
2. 細胞培養(yǎng)：細胞從生長表面（例如培養(yǎng)皿）分離，粘附細胞使用胰蛋白酶處理，懸浮細胞使用離心。將多達1X10^6個細胞/100微升分裝到聚苯乙烯管中，并在輕輕渦旋的同時加入70%的乙醇。
3. 細胞清洗：向細胞添加2毫升PBS，以300 X g離心5分鐘，然后將緩沖液從沉積的細胞中倒出。重復此步驟共2次，以除去殘留的培養(yǎng)基或血清成分。
4. 細胞重懸：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI儲備液）應加入到細胞懸液中，以達到所需的PI濃度。輕輕混合細胞和PI溶液以確保均勻染色。
5. 細胞孵育：根據(jù)實驗的需要，在37攝氏度下孵育細胞一段時間。通常在暗室中用PI孵育細胞超過30分鐘，以防止光照導致降解。
6. 分析細胞：孵育后，用PI染色的細胞可以使用流式細胞術(shù)進行分析，激光發(fā)出的光波長為488nm（藍綠色）來激發(fā)細胞。發(fā)出的熒光為紅色，波長為617nm。在免疫組織化學（IHC）中，PI常用作核染色劑，用于在組織切片中染色細胞核。
該方案應根據(jù)實驗要求和優(yōu)化進行調(diào)整。
碘化丙啶的優(yōu)點及常見問題
使用碘化丙啶染色技術(shù)的主要優(yōu)點是這些方法幾乎不會導致細胞損耗，并且可以避免通過水解引起的細胞損傷。然而，使用碘化丙啶也存在一些常見的問題。傳統(tǒng)的Annexin V/PI方案以及類似的染色方案可能導致相當數(shù)量的假陽性事件（>40%）。這種假陽性與碘化丙啶也會染色細胞質(zhì)內(nèi)的RNA有關(guān)。這個問題可能出現(xiàn)在初代細胞和細胞系中，最常見于核質(zhì)比較小的較大細胞。
由于碘化丙啶是一種不可穿透細胞膜的DNA染料，它通常與一種可穿透細胞膜的DNA染料一起用于細菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶對生物膜中貼壁細胞的染色已表現(xiàn)出明顯低于實際細菌活性的情況，這是由于細胞外核酸（eNA）的存在。觀察時，似乎會出現(xiàn)一層假死的紅色碘化丙啶染色細胞。這種情況有時會掩蓋一部分雙重染色的細胞，這些細胞內(nèi)部是綠色的，表明其活性，而紅色層則表明DNA可能位于整個細胞膜之外。
因此，這類細胞群體的活力染色結(jié)果使用另一種估計活力的方法進行驗證，例如，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）或熒光顯微鏡。在大多數(shù)情況下，碘化丙啶的使用限于固定或滲透的細胞，如果遇到活細胞則會被活細胞主動排出的細胞中。在滲透和固定過程中，通常選擇使用醇類或醛類試劑。重要的是，醛和醇通常與熒光蛋白和某些表面標記不兼容，因此對苯甲醛可能是更合適的選擇。就安全性而言，碘化丙啶是一種疑似致癌物質(zhì)，可能引起皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)刺激。
研究了流體剪切力（FSS）對腎小管細胞中凋亡和壞死的影響。HK-2細胞的密集單層在靜態(tài)條件（FSS 0）或0.5 Pa流體剪切應力（FSS 0.5）下培養(yǎng)48小時。A/細胞先用Annexin-V染色，然后立即通過流式細胞術(shù)分析磷脂酰絲氨酸的外翻（Annexin-V熒光，X軸）和碘化丙啶（PI）的攝�。≒I熒光，Y軸）。通過Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的標準區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞或壞死細胞（初級或次級）。B/早期凋亡和壞死細胞的比例進行了量化，結(jié)果以細胞總?cè)后w的百分比表示。數(shù)據(jù)表示7次實驗的平均值 ± SEM。*HK-2細胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根據(jù)制造商的指示評估凋亡和壞死。
產(chǎn) 品
表1.Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒選擇指南
表2.在死細胞和固定細胞中，用核酸染色標記細胞核
表3.Live or Dead細胞活性檢測試劑盒
表4.MycoLight熒光活/死細菌成像試劑盒
在樣品中加入碘化丙啶后，細胞膜永久性或可逆性損傷的細胞將發(fā)出紅色熒光。通過這種方式，碘化丙啶能夠快速且可靠地識別和定量死亡和壞死細胞。碘化丙啶有助于確定整體細胞活性，這是用于監(jiān)測細胞群體對細胞毒性藥物或其他環(huán)境因素的反應的重要參數(shù)。
活力研究通常包括使用碘化丙啶染色，搭配細胞凋亡標記染料（如Annexin V-FITC或發(fā)出明亮綠色熒光的iFluor® 488）。當一起使用時，可以獲得總細胞計數(shù)，并且可以觀察樣本中的細胞形態(tài)。例如，使用這兩種染色劑可以區(qū)分完整細胞（iFluor® 488-PI-）、早期凋亡細胞（iFluor® 488+PI-）和晚期凋亡或壞死細胞（iFluor® 488+PI+）。
碘化丙啶的化學結(jié)構(gòu)
PI染色方案
用PI染色細胞的基本方法如下:
1. 細胞準備：將PI（碘化丙啶）溶解在PBS或Tris-EDTA緩沖液等緩沖溶液中。染色溶液中PI的濃度可能因?qū)嶒灄l件而異，但通常為1-5mg/ml。
2. 細胞培養(yǎng)：細胞從生長表面（例如培養(yǎng)皿）分離，粘附細胞使用胰蛋白酶處理，懸浮細胞使用離心。將多達1X10^6個細胞/100微升分裝到聚苯乙烯管中，并在輕輕渦旋的同時加入70%的乙醇。
3. 細胞清洗：向細胞添加2毫升PBS，以300 X g離心5分鐘，然后將緩沖液從沉積的細胞中倒出。重復此步驟共2次，以除去殘留的培養(yǎng)基或血清成分。
4. 細胞重懸：含有PI的染色溶液（例如，PBS中0.1%的BSA、RNase、PI儲備液）應加入到細胞懸液中，以達到所需的PI濃度。輕輕混合細胞和PI溶液以確保均勻染色。
5. 細胞孵育：根據(jù)實驗的需要，在37攝氏度下孵育細胞一段時間。通常在暗室中用PI孵育細胞超過30分鐘，以防止光照導致降解。
6. 分析細胞：孵育后，用PI染色的細胞可以使用流式細胞術(shù)進行分析，激光發(fā)出的光波長為488nm（藍綠色）來激發(fā)細胞。發(fā)出的熒光為紅色，波長為617nm。在免疫組織化學（IHC）中，PI常用作核染色劑，用于在組織切片中染色細胞核。
該方案應根據(jù)實驗要求和優(yōu)化進行調(diào)整。
碘化丙啶的優(yōu)點及常見問題
使用碘化丙啶染色技術(shù)的主要優(yōu)點是這些方法幾乎不會導致細胞損耗，并且可以避免通過水解引起的細胞損傷。然而，使用碘化丙啶也存在一些常見的問題。傳統(tǒng)的Annexin V/PI方案以及類似的染色方案可能導致相當數(shù)量的假陽性事件（>40%）。這種假陽性與碘化丙啶也會染色細胞質(zhì)內(nèi)的RNA有關(guān)。這個問題可能出現(xiàn)在初代細胞和細胞系中，最常見于核質(zhì)比較小的較大細胞。
由于碘化丙啶是一種不可穿透細胞膜的DNA染料，它通常與一種可穿透細胞膜的DNA染料一起用于細菌活性研究中。然而，在研究中，碘化丙啶對生物膜中貼壁細胞的染色已表現(xiàn)出明顯低于實際細菌活性的情況，這是由于細胞外核酸（eNA）的存在。觀察時，似乎會出現(xiàn)一層假死的紅色碘化丙啶染色細胞。這種情況有時會掩蓋一部分雙重染色的細胞，這些細胞內(nèi)部是綠色的，表明其活性，而紅色層則表明DNA可能位于整個細胞膜之外。
因此，這類細胞群體的活力染色結(jié)果使用另一種估計活力的方法進行驗證，例如，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）或熒光顯微鏡。在大多數(shù)情況下，碘化丙啶的使用限于固定或滲透的細胞，如果遇到活細胞則會被活細胞主動排出的細胞中。在滲透和固定過程中，通常選擇使用醇類或醛類試劑。重要的是，醛和醇通常與熒光蛋白和某些表面標記不兼容，因此對苯甲醛可能是更合適的選擇。就安全性而言，碘化丙啶是一種疑似致癌物質(zhì)，可能引起皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)刺激。
研究了流體剪切力（FSS）對腎小管細胞中凋亡和壞死的影響。HK-2細胞的密集單層在靜態(tài)條件（FSS 0）或0.5 Pa流體剪切應力（FSS 0.5）下培養(yǎng)48小時。A/細胞先用Annexin-V染色，然后立即通過流式細胞術(shù)分析磷脂酰絲氨酸的外翻（Annexin-V熒光，X軸）和碘化丙啶（PI）的攝�。≒I熒光，Y軸）。通過Annexin-V-/PI-（左下象限）、Annexin-V+/PI-（右下象限）和Annexin-V+/PI+（右上象限）的標準區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞或壞死細胞（初級或次級）。B/早期凋亡和壞死細胞的比例進行了量化，結(jié)果以細胞總?cè)后w的百分比表示。數(shù)據(jù)表示7次實驗的平均值 ± SEM。*HK-2細胞使用Cell Meter Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit根據(jù)制造商的指示評估凋亡和壞死。
產(chǎn) 品
表1.Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒選擇指南
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | Ex/Em | 規(guī)格 |
| Cell Meter PE-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒 適用于流式細胞儀 | 22838 | 565/575nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒橙色熒光 405nm激發(fā) | 22830 | 527/550nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 綠色熒光 405nm激發(fā) | 22829 | 410/501nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 藍色熒光 405nm激發(fā) | 22828 | 406/445nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 深紅色熒光 適合流式細胞檢測 | 22827 | 656/670nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 紅色熒光 適合流式細胞檢測 | 22826 | 587/603nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 橙色熒光 適合流式細胞檢測 | 22825 | 557/570nm | 100 Tests |
| Cell Meter Annexin V凋亡檢測試劑盒 綠色熒光 適合流式細胞檢測 | 22824 | 491/516nm | 100 Tests |
| Cell Meter FITC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒 適合于流式細胞儀 | 22839 | 491/516nm | 100 Tests |
| Cell Meter APC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒 適合于流式細胞儀 | 22837 | 651/660nm | 100 Tests |
表2.在死細胞和固定細胞中，用核酸染色標記細胞核
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | Ex/Em | 規(guī)格 |
| 核藍DCS1死細胞染料 | 17548 | 348/469nm | 0.5mL |
| 死細胞核染料DiTO-15mM DMSO溶液 相當于TOTO-1 | 17575 | 514/531nm | 0.2ml |
| 核綠DCS1死細胞染料 | 17550 | 503/527nm | 0.5mL |
| 核綠DCS1光固定型死細胞核染料 | 17570 | 502/527nm | 1mg |
| 死細胞核染料TWO-PRO1相當于TO-PRO1 | 17571 | 515/531nm | 0.2mL |
| 核橙DCS1死細胞染料 | 17551 | 514/556nm | 0.5mL |
| 碘化丙錠PI | 17516 | 537/618nm | 5g |
| 碘化丙錠PI*10mM水溶液* | 17517 | 537/618nm | 1mL |
| 死細胞核染料DiYO-1 相當于YOYO1*5 mM DMSO Solution | 17580 | 491/508 | 0.2mL |
表3.Live or Dead細胞活性檢測試劑盒
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | Ex/Em | 規(guī)格 | |
| Live or Dead細胞活性檢測試劑盒 綠色/紅色雙熒光 | 22789 | 494/514 537/618 |
200Tests | |
| Live or Dead細胞活性檢測試劑盒 綠色/紅色雙熒光 | 22760 | 494/514 537/618 |
1000Tests | |
| Live or Dead細胞活性檢測試劑盒 紅/藍雙色熒光 | 22788 | 613/631 348/469 |
200Tests |
表4.MycoLight熒光活/死細菌成像試劑盒
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | Ex/Em | Em顏色 | 規(guī)格 |
| MycoLight熒光活/死細菌成像試劑盒 | 22411 | 488/530 537/618 |
綠（活） 紅（死） |
100Tests |
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