小動物活體成像技術，是在1999年美國哈佛大學Weisslede提出的一項技術，該技術是指應用影像學方法, 對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究。

 

傳統(tǒng)的動物實驗需要在多個時間點分批處死動物以獲取實驗數(shù)據(jù)，而小動物活體成像技術可同時觀測多個實驗動物、對同一研究個體可進行持續(xù)、反復跟蹤成像，避免屠殺動物而造成的組間差異，節(jié)省動物成本，被廣泛應用于生命科學研究領域。

 

其中小動物活體光學成像是通過一定方式對小動物進行光學標記，再通過成像技術及設備(如Revvity IVIS高端小動物活體光學成像系統(tǒng))對采集光信號，主要包括生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術。

 

PART/1  生物發(fā)光VS熒光

 

PART/2  生物發(fā)光成像原理
 

生物發(fā)光成像是指通過基因工程將熒光素酶報告基因插入細胞、細菌、病毒等基因組中，使其能夠正常表達，再將細胞、細菌或病毒轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)構建穩(wěn)定表達熒光素酶的轉(zhuǎn)基因動物，向動物體內(nèi)注射熒光素底物，底物與熒光素酶發(fā)生反應產(chǎn)生光信號，發(fā)光的強度與標記細胞的數(shù)目呈線性關系，可以分析動物體內(nèi)特定的基因表達、細胞發(fā)育和相關生物學進程。
 

常用的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶(Luciferase) 和海腎熒光素酶(Renilla)，螢火蟲熒光素酶所用的底物是D-luciferin(逐典貨號：CY057F1000)，光波長在540-600 nm，更容易透過組織，特別適合動物深部組織成像，大部分體內(nèi)實驗常用其作報告基因；海腎熒光素酶的底物是coelentarizine ，光波長在460-540 nm，在體內(nèi)的代謝較快。

 

圖1.生物發(fā)光成像原理示

 

PART/3  生物發(fā)光成像實驗步驟
 

01  標記腫瘤細胞

構建熒光素酶重組質(zhì)粒，細胞轉(zhuǎn)染，挑選單一抗性細胞克隆。

02  篩選陽性克隆細胞株

單一抗性克隆傳代，用Luciferase Assay System檢測熒光素酶活性(逐典貨號：CY058F1000KIT)，保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，將篩選出高效表達、陽性率接近100%的細胞株進行培養(yǎng)。

03  構建動物模型

根據(jù)實驗目的選擇皮下移植、原位移植、尾靜脈注射等方式接種已標記的腫瘤細胞。

04  注射底物熒光素

采用腹腔注射或尾靜脈注射熒光素底物到小鼠體內(nèi)，推薦濃度是15 mg/ml，10 g小鼠需要1.5 mg的熒光素底物，等待3min，然后給動物進行常規(guī)麻醉(氣麻、針麻皆可)。

尾靜脈注射：皮下移植瘤、全身性腫瘤、顱內(nèi)腫瘤模型。

腹腔注射：無特殊要求均可采用（大都采用此注射法）。

05  生物發(fā)光成像

注射熒光素底物后，約1 min擴散到小鼠全身,10 min后強度達到穩(wěn)定的最高點,在最高點持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h發(fā)光全部消失，建議根據(jù)動力學曲線確定具體時間。

06  螢光素酶活性的動力學曲線

將麻醉后的動物放置在成像室并拍攝第一張圖像后，每5-10 min連續(xù)拍照，持續(xù)40 min，獲得模型動物的D-螢光素鉀鹽吸收動力學曲線。

 

PART/4  生物發(fā)光成像效果影響因素

 

1.報告基因轉(zhuǎn)錄

每個細胞都應該包含相同拷貝數(shù)的報告基因。

2.啟動子的活性

啟動子的活性高，則熒光素酶的表達高，啟動子的活性低，則熒光素酶的表達低。熒光素酶表達量和發(fā)光強度成正比。根據(jù)此原理，用特定的啟動子驅(qū)動熒光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內(nèi)的特定條件下的表達情況，并檢測影響該啟動子表達的因素。

3.熒光素底物注射方式

熒光素底物注射的方式及其準確性影響生物分布，從而影響其局部組織濃度。

4.成像時間

熒光素底物在體內(nèi)一般10 min后強度達到穩(wěn)定的最高點,在最高點持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h發(fā)光全部消失，建議根據(jù)動力學曲線確定具體時間。

5.小鼠的毛發(fā)

小鼠毛發(fā)對光具有吸收及散射作用，建議對實驗小鼠剃毛。

 

PART/5  逐典高品質(zhì)D-熒光素鉀鹽
 

逐典D-螢光素鉀鹽，其優(yōu)點在于純度高（HPLC>=99%）,經(jīng)驗證的優(yōu)異的生物發(fā)光性能，以及高溶解度。游離形式的熒光素溶解度較差，而鉀鹽形式能做到較好的水溶性，逐典開發(fā)的高純度D-熒光素鉀鹽溶解度可達40mg/ml以上。

 

產(chǎn)品賣點：

01 高純度（HPLC驗證純度≥99%）

 

02 高溶解度，溶解度可達40 mg/ml

 

03 優(yōu)異的生物發(fā)光性能

底物過量條件下，熒光素酶濃度與熒光強度呈線性關系，與競品P品牌產(chǎn)品相比，性能相當

 

PART/6  客戶反饋