AlphaLISA®因其靈敏度、多功能性和與自動(dòng)化的內(nèi)在兼容性而被廣泛用于支持高通量篩選活動(dòng)。該技術(shù)遵循均質(zhì)、免洗的實(shí)驗(yàn)方案，當(dāng)專門(mén)的供體珠和受體珠通過(guò)結(jié)合反應(yīng)接近時(shí)，會(huì)產(chǎn)生可測(cè)量的光信號(hào)。通過(guò)使用AlphaLISA®來(lái)篩選化學(xué)文庫(kù)中破壞結(jié)合的能力，研究人員可以為苗頭到先導(dǎo)(Hit-to-Lead)進(jìn)展快速識(shí)別化合物。
 
盡管AlphaLISA®提供了許多好處，但該技術(shù)仍存在一些限制。首先，珠子有沉降的傾向，需要使用儀器來(lái)保持其均勻的懸浮液。AlphaLISA® 試劑也相對(duì)昂貴，這意味著必須盡量減少死體積以減少浪費(fèi)和降低成本。此外,供體微珠對(duì)光敏感，要求試劑遠(yuǎn)離陽(yáng)光直射且實(shí)驗(yàn)室照明變暗。
 
使用來(lái)自 Formulatrix 的 TEMPEST® 液體處理器，并與 HighRes Biosolutions® 合作將儀器與現(xiàn)有的自動(dòng)化平臺(tái)集成，圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員能夠在AlphaLISA®檢測(cè)中快速篩選重點(diǎn)化合物庫(kù)，篩選出早期癌癥候選藥物。該項(xiàng)目的成功得益于TEMPEST®的許多關(guān)鍵功能，即內(nèi)建的AlphaLISA®珠子再循環(huán)能力、從單個(gè)分液器分配多種試劑的能力以及極低的死體積。
 
   
AlphaLISA®是一種基于微珠相互接近的檢測(cè)方法
 
盡管AlphaLISA®可以根據(jù)所研究的分析物采用各種配置，但分析原理始終涉及兩個(gè)珠子相互作用以產(chǎn)生可測(cè)量的光信號(hào)。在此處描述的研究中，圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員利用AlphaLISA®技術(shù)篩選了一個(gè)包含大約 4,900 種化合物的庫(kù)，目的是識(shí)別能夠阻斷專有目標(biāo)蛋白與底物之間相互作用的單個(gè)分子。
 
在AlphaLISA®反應(yīng)過(guò)程中，使用鏈霉親和素包被的供體珠結(jié)合生物素化底物，使用抗His 包被的受體珠結(jié)合His標(biāo)簽的靶蛋白。然后用 680nm 的光激發(fā)供體珠子，使它們釋放單線態(tài)氧分子。由于靶-底物結(jié)合，供體珠和受體珠非常接近，單線態(tài)氧分子與受體珠的反應(yīng)導(dǎo)致波長(zhǎng)為 610nm 的光發(fā)射。
 
相反，當(dāng)目標(biāo)-底物相互作用被化合物阻斷時(shí)，珠子相距太遠(yuǎn)，單線態(tài)氧轉(zhuǎn)移無(wú)法有效進(jìn)行，且無(wú)法檢測(cè)到610nm的光信號(hào)（見(jiàn)圖2）。
   
TEMPEST® 再循環(huán)功能可防止由于AlphaLISA®珠子沉降引起的測(cè)定漂移
 
AlphaLISA®珠子因其沉降傾向而為人所知，這種特性會(huì)導(dǎo)致隨時(shí)間而顯著的實(shí)驗(yàn)漂移和信號(hào)完全丟失。解決此問(wèn)題的一種方法是在AlphaLISA®測(cè)定期間用磁力攪拌器不斷混合供體和受體珠溶液，但這種方法并不總是能保證有效混合（例如，在磁棒未對(duì)準(zhǔn)的情況下）；如果裝有珠子的容器意外翻倒，這也可能導(dǎo)致有價(jià)值的試劑丟失。
 
TEMPEST®可以選擇以預(yù)設(shè)間隔重新充注儀器芯片，再循環(huán)AlphaLISA®珠試劑，以在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中保持均勻的懸浮液。充注芯片會(huì)將珠子返回到試劑容器中，不僅在容器內(nèi)混合溶液，而且還確保芯片中的試劑保持活性（見(jiàn)圖3）。通過(guò)將再循環(huán)間隔設(shè)置為1分鐘，圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員消除了微珠沉降問(wèn)題，而不會(huì)因操作錯(cuò)誤而導(dǎo)致試劑損失的風(fēng)險(xiǎn)。
   
TEMPEST® 低死體積最大限度地減少試劑浪費(fèi)
 
任何涉及自動(dòng)試劑分配的分析都必須在使用前考慮與儀器充注相關(guān)的死體積。由于AlphaLISA® 試劑相當(dāng)昂貴，因此將死體積保持在最低限度通常是首要考慮的問(wèn)題，尤其是對(duì)于那些進(jìn)行高通量篩選實(shí)驗(yàn)的人。通過(guò)使用TEMPEST® 將AlphaLISA®珠添加到測(cè)定板，研究人員可以憑借非常低的充注體積來(lái)降低成本。

圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員估計(jì)，他們將需要大約65-66毫升的每種微珠試劑來(lái)運(yùn)行初始AlphaLISA®篩選，同時(shí)使用TEMPEST®液體處理器進(jìn)行微珠添加。在確定70毫升的制劑足以測(cè)試所有4,900種化合物而不會(huì)耗盡試劑后，他們指出，這一體積將產(chǎn)生大約12%的總廢物。相比之下，使用現(xiàn)有的分配器，計(jì)算出的浪費(fèi)接近30%，因?yàn)樾枰獮槊總�(gè)篩分板充注和排空管道，以保持均勻的溶液。浪費(fèi)的微珠從30%減少到12%，這轉(zhuǎn)化為可觀的成本節(jié)約，突出了TEMPEST®在提高分析效率方面的效用（見(jiàn)圖 4）。
   
靈活性的增強(qiáng)改進(jìn)了現(xiàn)有的AlphaLISA®工作流程
 
許多自動(dòng)化的高通量檢測(cè)由于試劑輸入能力低而導(dǎo)致時(shí)間線延長(zhǎng)。例如，使用單一的傳統(tǒng)分液器分配AlphaLISA®測(cè)定的每個(gè)單獨(dú)成分，需要在實(shí)驗(yàn)期間多次清洗管道，增加了大量的延遲和手動(dòng)步驟，無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。盡管通過(guò)在同一檢測(cè)中組合多個(gè)分液器可以縮短時(shí)間，并使檢測(cè)完全自動(dòng)化，但空間的可用性往往使其不切實(shí)際。
 
TEMPEST®液體處理儀能夠從一個(gè)芯片中分配多達(dá)12種試劑，大大增強(qiáng)了測(cè)定的靈活性。能夠用一臺(tái)儀器將兩種微珠試劑溶液分配到同一個(gè)檢測(cè)板上，使圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員能夠簡(jiǎn)化AlphaLISA®工作流程，并設(shè)計(jì)出以前只限于單一試劑輸入的檢測(cè)方法（見(jiàn)圖5）。
   
高質(zhì)量的AlphaLISA®篩選性能轉(zhuǎn)化為強(qiáng)大的苗頭化合物鑒定
 
在使用TEMPEST®對(duì)所有AlphaLISA®微珠添加的4900個(gè)化合物庫(kù)進(jìn)行篩選后，圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員以多種方式評(píng)估了篩選數(shù)據(jù)的質(zhì)量。使用z'因子作為測(cè)定窗口和每個(gè)控制孔內(nèi)的變異性的綜合衡量標(biāo)準(zhǔn)，他們發(fā)現(xiàn)AlphaLISA®測(cè)定可靠地產(chǎn)生z'因子，高于設(shè)定的截止值（0.5），并且在整個(gè)篩選過(guò)程中表現(xiàn)出板與板之間的一致性，沒(méi)有隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)重大變化（見(jiàn)圖6）。
 
支持這一發(fā)現(xiàn)的還有，很明顯，陽(yáng)性和陰性對(duì)照之間沒(méi)有重疊，而且各孔板的對(duì)照值變化很小。這使我們有信心識(shí)別出18種化學(xué)化合物，并逐步進(jìn)行劑量反應(yīng)測(cè)試，其中2 1種化合物（IC50 < 1µM)目前正在進(jìn)行進(jìn)一步研究。
圣裘德兒童研究醫(yī)院的研究人員證明了TEMPEST®是AlphaLISA®的一項(xiàng)強(qiáng)大技術(shù)，展示了它與其他基于磁珠的高通量篩選的潛力。TEMPEST的很多附加產(chǎn)品特性增強(qiáng)了其再循環(huán)功能、低死體積和儀器的靈活性，而所有這些特性都支持現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，增加了新興測(cè)定技術(shù)的范圍。