SCIENION點(diǎn)樣技術(shù)在DNA合成的半導(dǎo)體芯片進(jìn)行表面功能化處理中的應(yīng)用
SCIENION* EVONETIX利用 SCIENION 的精密點(diǎn)樣技術(shù)對(duì) EVONETIX 用于 DNA 合成的半導(dǎo)體芯片進(jìn)行表面功能化處理
摘要
在這項(xiàng)研究中，Evonetix公司和 Scienion公司合作開(kāi)發(fā)了一種在硅半導(dǎo)體芯片上進(jìn)行高度并進(jìn)行DNA 合成的可擴(kuò)展工藝。利用 Scienon 的精密點(diǎn)樣技術(shù)，在 Evonetix的 DNA合成平臺(tái)上點(diǎn)樣了一個(gè)啟動(dòng)DNA合成的鏈接物 ,直徑為100微米的金點(diǎn)。研究結(jié)果表明，鏈接物可以精確地放置在反應(yīng)點(diǎn)上，從而最大限度地減少溢出，并最大限度地減少相鄰 DNA 序列之間的串?dāng)_。Evonetix 在 DNA 合成研究中成功證明了涂層芯片的功能。
Evonetix
Evonetix公司是一家總部位于劍橋的公司，致力于開(kāi)發(fā)新型半導(dǎo)體技術(shù)，以大規(guī)模生成高保真度的DNA。
這款桌面DNA合成平臺(tái)提供了前所未有的精確度、規(guī)模和速度進(jìn)行DNA合成的能力。
DNA合成在半導(dǎo)體芯片上實(shí)現(xiàn)的獨(dú)立溫控反應(yīng)點(diǎn)位上進(jìn)行（圖 1）。
在反應(yīng)位點(diǎn)上沉積一層薄薄的金屬層，下一步將使用內(nèi)部開(kāi)發(fā)的基底涂層對(duì)其進(jìn)行功能化處理。
該涂層可實(shí)現(xiàn)與金屬點(diǎn)的共價(jià)結(jié)合，隨后固定連接體。連接體帶有一個(gè)活性頭基的分子，用于結(jié)合第一個(gè)磷酰胺酸二酯，啟動(dòng)單鏈DNA合成。芯片本身被組裝到一塊印刷電路板中。芯片頂部有一個(gè)流體室。
SCIENION
Scienion GmbH 是一家提供完整解決方案的公司，
專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)和制造用于診斷和其他生命科學(xué)領(lǐng)域的微型化多重檢測(cè)。
Scienion 公司的核心技術(shù)基于皮升和納升范圍內(nèi)的非接觸點(diǎn)樣，起點(diǎn)為 10 pL/滴。除了儀器和耗材，Scienion 還提供一系列定制開(kāi)發(fā)和制造服務(wù)。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們進(jìn)行了原理驗(yàn)證 (POP) 研究，以了解 Evonetix 半導(dǎo)體芯片上的點(diǎn)樣工藝技術(shù)。
最后，Scienion的點(diǎn)樣技術(shù)成功應(yīng)用于功能化Evonetix的DNA合成平臺(tái)。
因此，在已預(yù)先預(yù)涂的100微米大的金反應(yīng)位點(diǎn)上分配了一個(gè)連接物，以啟動(dòng)半導(dǎo)體芯片上的DNA合成。
包括:(1)壓電點(diǎn)樣毛細(xì)管;(2)點(diǎn)樣后用于對(duì)目標(biāo)成像的垂直攝像頭;(3)用于可視化和量化滴液參數(shù)的高分辨率攝像頭。
結(jié)果與討論
初步研究
首先，利用 Scienion 的定制開(kāi)發(fā)服務(wù)，進(jìn)行了一項(xiàng)初步研究,以了解芯片表面、滴液量和斑點(diǎn)直徑之間的相互作用。
表面潤(rùn)濕性對(duì)光斑直徑的影響
為了估算覆蓋 Evonetix 芯片上 100 µm 直徑金反應(yīng)位點(diǎn)所需的滴液體積，使用 Scienion 的精密點(diǎn)樣技術(shù)將不同體積（80 - 320 pL）的水滴點(diǎn)樣到不同的目標(biāo)上。通過(guò)垂直攝像頭拍攝沉積的滴液（斑點(diǎn)）的照片，并通過(guò) sciFLEX 軟件分析它們的直徑。此外，還對(duì)相關(guān)支撐材料進(jìn)行了水接觸角測(cè)量，以分析它們的潤(rùn)濕性質(zhì)。最后，還評(píng)估了潤(rùn)濕性質(zhì)對(duì)斑點(diǎn)直徑的影響。
作為研究的主要支持物，使用未涂層的金基片（CA：96°）和基底涂層金基片（CA：95°）來(lái)模擬金位點(diǎn)。這兩種載玻片均由 Evonetix 公司提供。為了進(jìn)行比較，另外使用了sciCHIP H2（CA：106°）和sciCHIP Epoxy（CA：53°）載玻片作為額外的參考表面。
不同緩沖條件對(duì)斑點(diǎn)形成（斑點(diǎn)大�。┑挠绊�
Evonetix的半導(dǎo)體芯片上直徑100 µm的反應(yīng)位點(diǎn)需要覆蓋DNA連接劑。我們研究了三種緩沖液中哪種最適合將 DNA 連接固定在預(yù)涂覆的金位點(diǎn)上。此外，將滴液量在200 pL和3200 pL之間變化，以評(píng)估最佳分配體積。檢測(cè)在涂有金的載玻片上進(jìn)行，以研究緩沖液組成和滴液量對(duì)斑點(diǎn)形成的影響。
以 200 pL/滴/輪的順序分配 200 - 3200 pL/斑點(diǎn)，輪次之間等待時(shí)間為2分鐘。每個(gè)序列后測(cè)量斑點(diǎn)直徑（圖4）。使用了Evonetix提供的Evx緩沖液和Scienion提供的sciSPOT B2作為緩沖試劑。此外，Evx緩沖液與sciSPOT B2混合，結(jié)合了兩種緩沖液的特性。
使用Evx 緩沖液時(shí)，分配200 pL 時(shí)，光斑直徑為 98 ± 2 µm，分配 400 pL 時(shí)，光斑直徑為 127 ± 3 µm。沉積 800 pL 后，每多沉積一輪，光斑直徑增加不到 10%。使用sciSPOT B2 緩沖液時(shí)，200 pL 的直徑為 102 ± 2 µm，400 pL 的直徑為 115 ± 5 µm。每增加一輪點(diǎn)樣，光斑直徑幾乎線(xiàn)性增加 5-13%。使用Evx 緩沖液 + sciSPOT B2 緩沖液時(shí)，200 pL 的光斑直徑為 79 ± 3 µm，400 pL 的光斑直徑為 110 ± 2 µm。
在 200 - 800 pL（增加 40-47%）和 800 - 3200 pL（增加 4-13%）之間，光斑直徑幾乎呈線(xiàn)性增長(zhǎng)(增加 4-13%）。
覆蓋 100 µm 圖層金表面所需的體積約為 200 pL。所有測(cè)試的三種緩沖液都能覆蓋目標(biāo)的光斑直徑。我們決定使用Evx 緩沖液 + sciSPOT B2 緩沖液 的組合特性來(lái)沉積 DNA 連接體，以達(dá)到最佳固定效果。
利用 Scienion 的精密點(diǎn)樣技術(shù)實(shí)現(xiàn) Evonetix 芯片的功能化
Evonetix的芯片具有獨(dú)立溫度控制的反應(yīng)位點(diǎn)，在Scienion處進(jìn)行了基底涂層的功能化處理。芯片被組裝到芯片載體中，連接到流體夾具上，進(jìn)行清洗，并根據(jù)Evonetix提供的方案進(jìn)行反應(yīng)性和熱穩(wěn)定性涂層的功能化處理。在接下來(lái)的步驟中，帶有芯片的載體被放置在sciFLEXARRAYER SX的靶板上（見(jiàn)圖5）。靶板冷卻至8°C，相對(duì)濕度設(shè)定為65%。
作為試劑，ssDNA-Cy5 和一個(gè)連接物被打印在反應(yīng)位點(diǎn)上。第一種試劑用作陽(yáng)性對(duì)照，而第二種試劑可在隨后的合成過(guò)程中固定第一個(gè) DNA 堿基。大約需要200pL試劑才能覆蓋直徑為100µm 的反應(yīng)位點(diǎn)，確保不會(huì)溢出到相鄰區(qū)域（圖6），這驗(yàn)證了在不同緩沖液條件下的初步研究結(jié)果。
201 pL/滴磷酸鹽緩沖液中的連接體。
(b) 204 pL/drop of ssDNA-Cy5 in Evx buffer +sciSPOT B2 mix204 pL/滴ssDNA-Cy5，Evx 緩沖溶液 +sciSPOT B2 混合液。
圖6：通過(guò) sciFLEXARRAYER SX的水平攝像頭拍攝的200 pL水平圖像。
芯片上的反應(yīng)位點(diǎn)按三個(gè)區(qū)域排列，每個(gè)區(qū)域有3x3個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。
每個(gè)區(qū)域內(nèi)的反應(yīng)點(diǎn)之間的間距為400微米（雙向），區(qū)域之間的間距為2800微米。
在點(diǎn)樣過(guò)程中，每個(gè)區(qū)域的 3/3 位點(diǎn)留空，ssDNA-Cy5 沉積在 2/2 位點(diǎn)（中心點(diǎn)）。
連接物被沉積在其余位點(diǎn)上（圖7）。
試劑按兩輪順序預(yù)埋：先噴 200 pL 試劑，5 分鐘后再在每個(gè)部位沉積 200pL相同的試劑，以增加試劑的累積量。最終的平均光斑直徑為 120 µm ± 10 µm，這表明溢出極少。沉積完成后，芯片在相對(duì)濕度為 70% 的室溫下培養(yǎng)過(guò)夜。剩余的試劑通過(guò)清洗程序從表面清除。
ssDNA被合成在所有連接功能化的金位點(diǎn)上（陽(yáng)性對(duì)照的2/2位和空位3/3除外），并與 ROX 標(biāo)記的互補(bǔ) ssDNA 雜交。使用 Leica DMi8 熒光顯微鏡觀察 ROX 標(biāo)記的 ssDNA 的熒光圖像表明，在先前連接功能化的反應(yīng)位點(diǎn)上成功合成了目標(biāo) ssDNA（圖 8a）。測(cè)得的熒光強(qiáng)度為 5715 ± 395 RFU，是 3/3 位置未功能化反應(yīng)位點(diǎn)（1130 ± 90 RFU）的 5 倍。陽(yáng)性對(duì)照ssDNA-Cy5在2/2位置的熒光強(qiáng)度比未涂層的反應(yīng)位點(diǎn)高出9倍（陽(yáng)性位點(diǎn)：17117 ± 4248 RFU；未涂點(diǎn)的對(duì)照位點(diǎn)：1911 ± 87 RFU）。
圖 8：使用 Leica DMi8 熒光顯微鏡在同一芯片上拍攝的熒光圖像（a）ROX 標(biāo)記的輔助 ssDNA 與合成在連接器功能化位點(diǎn)上的ssDNA雜交后的圖像（LED 激發(fā) 560 納米，發(fā)射濾光片 592-668 納米，5 倍放大鏡）
b）陽(yáng)性對(duì)照的熒光圖像（LED 激發(fā) 635 納米，發(fā)射濾光片 666-724 納米，5 倍放大鏡）。
隨后的研究中，我們?cè)诮鹞稽c(diǎn)上沉積了3滴連接劑，
以研究固定連接劑的密度如何影響ssDNA的合成量：2滴、6滴和 8滴（每滴 200 pl）。
與ROX標(biāo)記的互補(bǔ)ssDNA雜交后，拍攝熒光圖像（Leica DMi8熒光顯微鏡）并測(cè)量熒光強(qiáng)度（圖 9）。
可以得出的結(jié)論是，隨著固定的連接劑的增加，熒光強(qiáng)度也隨之增加，合成的ssDNA量也隨之增加。
6滴/點(diǎn)的沉積導(dǎo)致熒光強(qiáng)度：
- 與沉積2滴連接劑后的熒光強(qiáng)度相比幾乎高出3倍
- 與沉積8滴/點(diǎn)連接劑后獲得的熒光強(qiáng)度相比處于同一數(shù)量級(jí)。
結(jié)論
Scienion的精密點(diǎn)樣技術(shù)成功應(yīng)用于Evonetix開(kāi)發(fā)的DNA合成平臺(tái)的100微米大金位點(diǎn)的功能化。
我們對(duì)不同的點(diǎn)樣參數(shù)（包括緩沖液和連接劑濃度）進(jìn)行了評(píng)估，以確定DNA合成的最佳參數(shù)。
我們能夠證明，在同一反應(yīng)位點(diǎn)上點(diǎn)樣 2-3 滴（200 pL）連接劑會(huì)導(dǎo)致信號(hào)增加。點(diǎn)樣六滴足以使點(diǎn)樣區(qū)域的反應(yīng)位點(diǎn)達(dá)到飽和，超過(guò)飽和后，信號(hào)不再增加。
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