貼壁細(xì)胞（adherent cells），這類細(xì)胞的生長必須有可以貼附的支持物表面，如：培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼壁因子才能在該表面上生長，繁殖。細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始進(jìn)行有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。
 

當(dāng)細(xì)胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞性或上皮樣細(xì)胞。貼壁細(xì)胞生長過程分為五個時期，分別是游離期、貼壁期、潛伏期、對數(shù)期、平臺期和衰退期。

 

貼壁細(xì)胞因其培養(yǎng)過程較為繁瑣，所以培養(yǎng)時更容易出現(xiàn)問題。今天，就圍繞貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中常見的5大常見問題，與大家一起探討詳細(xì)原因和解決方法。
 

一，傳代后部分細(xì)胞漂浮

原因及解決方法如下

1，傳代前細(xì)胞密度太大：：一般細(xì)胞融合度達(dá)到80%時就可以進(jìn)行傳代操作了，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導(dǎo)致傳代后漂浮；

2，細(xì)胞狀態(tài)不好：可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善；

3，吹打次數(shù)過多造成機械損傷：輕柔吹打，細(xì)胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產(chǎn)生；

4，培養(yǎng)基更換后不適應(yīng)：更換回原來的培養(yǎng)基；或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細(xì)胞有個適應(yīng)期；

5，培養(yǎng)液配制、儲存不當(dāng)，如pH值過堿，Gln量太少等原因；

6，接種細(xì)胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)；

7，復(fù)蘇時處理速度太慢，復(fù)蘇過程不當(dāng)。

二，傳代后細(xì)胞變形

原因及解決方法如下

1，變形，但細(xì)胞還在生長：可能是血清批次不一樣導(dǎo)致，血清成分復(fù)雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細(xì)胞有過渡期；

2，變形，但細(xì)胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當(dāng)，或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài)；消化時間根據(jù)每個細(xì)胞的狀態(tài)來調(diào)整，消化過度或者消化不充分均會對細(xì)胞造成影響；培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，實驗環(huán)境盡量潔凈，確保細(xì)胞無外源污染。

三，細(xì)胞生長周期變慢，邊養(yǎng)邊漂

原因及解決方法如下

1，細(xì)胞傳代時密度太稀或太密：建議細(xì)胞融合度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期，密度過高會有接觸抑制；

2，傳代操作不當(dāng)：根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化，難消化的細(xì)胞可分次消化，每次時間不超過5min；頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時間間隔為2~3天。

四，傳代后細(xì)胞成團(tuán)

解決方法如下

1，低密度接種，延長換液時間，防止細(xì)胞脫落；

2，使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細(xì)胞貼壁牢固度，降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率；

3，重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例（增加比例不超過5%）；

4，接種時，減少培養(yǎng)基量（如T25加3mL）以加快細(xì)胞貼壁速度，等待細(xì)胞貼壁后（約8-12小時），再補加培養(yǎng)基到正常用量。

五，細(xì)胞出現(xiàn)空泡

原因及解決方法如下

1，正常的細(xì)胞活動：有的細(xì)胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動，無需特殊處理（如Caco-2細(xì)胞）；

2.血清不適應(yīng)、培養(yǎng)基成分改變、換液不及時等造成細(xì)胞營養(yǎng)不良：可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決；

3，機械損傷、PH偏高或偏低等造成細(xì)胞受損：注意培養(yǎng)條件及操作手法。

六，如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁

1，適度消化細(xì)胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細(xì)胞處理時間可適當(dāng)放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細(xì)胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

2，最好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進(jìn)行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細(xì)胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3，正確配制消化液或培養(yǎng)液。

4，使用合適的細(xì)胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

5，復(fù)蘇新的細(xì)胞，第一周用20%血清幫助細(xì)胞復(fù)原。

6，傳代接種一定要鋪的均勻，避免細(xì)胞抱團(tuán)生長。

7，細(xì)胞傳代24小時之內(nèi)，最好不要晃動，以免影響貼壁。

8，體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細(xì)胞生長。
 

逐典TrypLUS消化液是一種胰蛋白酶類似物（Trypsin Like Enzyme），是一種通過生物工程制備的非動物源性重組蛋白酶，與胰蛋白酶有相似的解離動力學(xué)，穩(wěn)定性更高，純度更好，消化更溫和，細(xì)胞毒性更低。目前主要應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)中，可以在賴氨酸和精氨酸的C末端切割肽鍵，可以替代豬或牛胰蛋白酶（Trypsin）對貼壁細(xì)胞的消化解離。生物制藥中，GMP級別的TrypLUS能夠為疫苗生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)提供高質(zhì)量和高性價比的貼壁細(xì)胞消化解決方案。

 

逐典TrypLUS消化液優(yōu)勢

1. DMF備案

2. 非動物來源

3. 室溫貯存，無需胰酶抑制劑，稀釋即可終止

4. 消化溫和，消化后細(xì)胞活性高

5. 即開即用，方便快捷

逐典TrypLUS消化液應(yīng)用案例