聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。PCR結(jié)果不滿意時(shí)，首先要冷靜分析可能的原因，并參考以下建議進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1. 樣本質(zhì)量與處理：確保采集的樣本具有代表性，避免污染和交叉污染。樣本的保存和處理要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，以保證樣本中的核酸完整性和穩(wěn)定性。

2. 引物設(shè)計(jì)：引物的特異性和退火溫度對(duì)PCR結(jié)果至關(guān)重要。引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)充分考慮目標(biāo)序列的特異性，避免引物之間的互補(bǔ)和非特異性結(jié)合。

3.PCR條件優(yōu)化：針對(duì)不同的模板和引物，優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件，如退火溫度、延伸時(shí)間等。同時(shí)，選擇合適的PCR酶和緩沖液體系，以提高擴(kuò)增效率。

4. 抑制劑和污染物的排除：抑制劑和污染物可能影響PCR的擴(kuò)增效果。因此，在PCR反應(yīng)前，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，以去除可能的抑制劑和污染物。

5. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證：當(dāng)PCR結(jié)果不滿意時(shí)，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。同時(shí)，可以采用其他方法如測(cè)序、實(shí)時(shí)定量PCR等對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

6. 記錄與分析：詳細(xì)記錄每次PCR實(shí)驗(yàn)的條件和結(jié)果，分析可能導(dǎo)致結(jié)果不滿意的因素，并據(jù)此進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。

參考建議：

1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。

2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)”開(kāi)始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。

3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。

4、對(duì)于有問(wèn)題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

5、沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無(wú)MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。

6、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。

7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。

8、檢查模板和引物的用量。

9、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。

10、泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過(guò)68℃。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。

11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。

12、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度。DNA片段長(zhǎng)度可以超過(guò)50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過(guò)程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類(lèi)引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來(lái)增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。

13、變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過(guò)程中盡可能縮短變性時(shí)間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過(guò)12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。

14、延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無(wú)此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來(lái)的8分鐘。長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。

15、引物設(shè)計(jì)： 一般長(zhǎng)度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)； 引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。

經(jīng)DEPC處理好的東西如EP管,剪刀等接下來(lái)該怎么辦？是用雙蒸水沖洗,還是用DEPC處理的水沖洗？

溫馨提示：

經(jīng)DEPC處理好的EP管,應(yīng)該去高壓，既滅菌又去除了DEPC，DEPC再?zèng)]高壓的情況下是有毒性的。剪刀等浸泡后用DEPC處理的水沖洗。

處理過(guò)程應(yīng)該是這樣的：在ddH2O中加入0.1％的DEPC，用攪拌子攪拌2小時(shí)，使DEPC充分溶解在水里。然后將EP管,tip頭及大離心管etc浸入以上水中，后放入37度培養(yǎng)箱中過(guò)夜，第二天倒掉液體后高壓。（不是僅僅DEPC處理的水沖洗就可以的）。DEPC處理的水不重復(fù)使用。

經(jīng)DEPC處理好的東西如EP管,應(yīng)先在70-80度烤干后，再高壓剪刀玻璃制品可以用DEPC處理后180-200度干烤2小時(shí)。

通過(guò)以上建議的實(shí)施，我們可以逐步排除可能導(dǎo)致PCR結(jié)果不滿意的因素，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，為未來(lái)的研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。