多重核酸檢測(cè)技術(shù)是指在同一管反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)核酸靶標(biāo)擴(kuò)增與檢測(cè)的技術(shù)，該技術(shù)具有可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)、在提高檢測(cè)通量的同時(shí)簡(jiǎn)化操作方法，且能降低檢測(cè)成本，滿足病原微生物鑒定、肉源成分溯源、轉(zhuǎn)基因成分分析等檢測(cè)需求。近年來，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種團(tuán)隊(duì)圍繞CRISPR/Cas系統(tǒng)，分別開發(fā)了熒光增強(qiáng)型核酸可視化檢測(cè)以及直接裸眼核酸可視化檢測(cè)技術(shù)（RAVI-CRISPR）。然而，如何實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)多重核酸可視化檢測(cè)依然是一個(gè)難題。

近日，該研究團(tuán)隊(duì)在已有工作基礎(chǔ)上，建立了一種新的多重RAVI-CRISPR核酸熒光可視化檢測(cè)技術(shù)。該項(xiàng)工作主要亮點(diǎn)在于，研究人員針對(duì)多達(dá)28對(duì)不同熒光基團(tuán)修飾的單鏈DNA熒光-淬滅報(bào)告基因（ssDNA-FQ）兩兩組合，利用Exo I核酸外切酶進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)，篩選到能用于Cas12a和Cas13a多重核酸熒光可視化檢測(cè)的最佳報(bào)告基因組合。非常有趣的是，通過比較反應(yīng)溶液熒光顏色變化特征，發(fā)現(xiàn)ROX和JOE修飾的報(bào)告基因兩兩組合時(shí)，當(dāng)報(bào)告基因單獨(dú)或組合存在時(shí)，被切割降解后會(huì)引起反應(yīng)溶液顏色發(fā)生“紅－綠－黃”變化，類似于交通信號(hào)燈的顏色轉(zhuǎn)變，色差明顯，非常適合用于針對(duì)多重核酸靶標(biāo)裸眼可視化檢測(cè)。 進(jìn)一步，該研究團(tuán)隊(duì)利用新開發(fā)的多重RAVI-CRISPR技術(shù)，分別建立了非洲豬瘟病毒、CD163基因敲除和乳鐵蛋白基因敲入豬多重核酸檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該技術(shù)可以達(dá)到10^1拷貝/微升的檢測(cè)靈敏度性，并且檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)PCR完全一致。該技術(shù)最大優(yōu)勢(shì)在于僅需小型便攜式恒溫儀和熒光檢測(cè)裝置即可開展現(xiàn)場(chǎng)核酸多重檢測(cè)。未來若結(jié)合微流控芯片技術(shù)，其在畜禽病原核酸現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè)方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

該項(xiàng)研究成果于2023年7月11日以題為“Development of a Naked Eye CRISPR-Cas12a and Cas13a Multiplex Point-of-Care Detection of Genetically Modified Swine”發(fā)表于國際期刊ACS Synthetic Biology。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院碩士研究生王緣和付蘭婷為該論文的共同第一作者，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)謝勝松教授、李長春教授、阮進(jìn)學(xué)副研究員為論文共同通訊作者。該研究得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委創(chuàng)新研究群體基金、湖北省洪山實(shí)驗(yàn)室重大項(xiàng)目等項(xiàng)目資助。