當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度（70%-80%）后，將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細(xì)胞會在培養(yǎng)瓶中長成致密單層（懸浮細(xì)胞會充滿整個體積的培養(yǎng)液），并鋪滿培養(yǎng)瓶底部，如果不及時進行分瓶處理，細(xì)胞將會逐漸走向衰老、死亡。

而將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中進行擴大培養(yǎng)，稱為細(xì)胞傳代。

一：細(xì)胞傳代目的

1、 完成細(xì)胞數(shù)量的擴增。

2、 避免因細(xì)胞進入平臺期或衰亡期，而發(fā)生大量死亡。

二：細(xì)胞傳代步驟參考（以T25瓶為例）

 

貼 壁 細(xì) 胞

1、吸去培養(yǎng)液：取對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞（細(xì)胞融合度70%-80%）。吸去培養(yǎng)上清液，用不含鈣、鎂離子的PBS 2 mL潤洗細(xì)胞1-2次。

細(xì)胞融合度判斷參考圖
 

2、加消化液：加1 mL胰酶消化液于培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，使胰酶消化液均勻地浸潤細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。

3、消化觀察：期間可在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落，準(zhǔn)備終止消化。

4、加培養(yǎng)基終止消化：加入3-4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，緩慢吹打細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到離心管中。

5、離心：將細(xì)胞懸液放入離心機配平，進行離心（800-1000 rpm，3-5 min）。

6、棄上清：去掉細(xì)胞上清液。

7、重懸細(xì)胞：用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到新的培養(yǎng)器皿中。

8、分裝：根據(jù)細(xì)胞生長特性和后續(xù)的實驗要求，進行分裝傳代的操作。

 

懸 浮 細(xì) 胞

1、收集：輕輕吹散懸浮細(xì)胞，部分貼壁松散的懸浮細(xì)胞可直接吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中。

2、離心棄上清：按離心800-1000 rpm，3-5 min，進行操作，離心完吸出上清摒棄。

3、接種傳代：加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按比例接種至培養(yǎng)瓶（接種比例按實際情況，不確定可計數(shù)后再接種），常規(guī)細(xì)胞推薦以3-5*10^5 cells/mL傳代。

 

半 貼 半 懸  細(xì) 胞

1、收集懸浮細(xì)胞：用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中（懸浮細(xì)胞部分）。

2、收集貼壁細(xì)胞：用1 mL PBS清洗細(xì)胞，吸出后放入上述離心管中（貼壁細(xì)胞部分）。

3、加消化液：培養(yǎng)瓶中加入1 mL 胰酶消化液，放入培養(yǎng)箱中靜置消化。

4、消化觀察：消化的時間依據(jù)細(xì)胞本身特性，可邊消化邊觀察，細(xì)胞大部分脫落或變圓，即可終止消化，全程不要拍打培養(yǎng)瓶。

5、接種傳代：按照適當(dāng)?shù)谋壤�接種新的培養(yǎng)瓶進行傳代培養(yǎng)。

三：細(xì)胞傳代注意事項

 

1、牢記無菌意識；

2、把握傳代時機，對數(shù)增長期或細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%進行傳代；

3、均勻消化，減少細(xì)胞團塊的形成；

4、吹打過程動作的輕柔，避免產(chǎn)生氣泡；

5、適度消化；

6、傳代比例合適，避免細(xì)胞傳代頻繁或代次紊亂；

7、使用一次性移液管，避免交叉污染。

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