熒光定量PCR中反應中的Ct值全面分析
熒光定量PCR（qPCR）是目前病原檢測領域使用最為廣泛的核酸檢測方法（PCR檢測技術(shù)概述）。尤其是非洲豬瘟發(fā)生后，qPCR檢測得到了極大的普及，對于剛剛進入qPCR檢測領域的人，很容易鉆入了“唯Ct值"的牛角尖，下面來詳細介紹qPCR中的Ct值。
1、Ct值的基本概念
閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越��；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
2、Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內(nèi)，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認為無意義。
3、Ct值的影響因素
由擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個數(shù)，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產(chǎn)生影響。模板質(zhì)量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。
擴增效率Efficiency (En):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
4、與Ct值有關(guān)的參數(shù)
標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。
相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。
擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。
5、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系
理想情況下，qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進行指數(shù)擴增，擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結(jié)果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。
用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結(jié)果。
6、qPCR中Ct值的幾點思考
①、Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？
通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質(zhì)等定量準確的物質(zhì)（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結(jié)果仍存在一定的誤差。
②、熒光定量PCR是否為定量方法？
雖然名字里有“定量”，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，并不絕對準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。
③、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？
qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（最低檢測限），分析特異性（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優(yōu)劣并不夠科學，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環(huán)的預擴增，再進行正式循環(huán)的做法就是為了使Ct值看起來更低。
④、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？
不能！
理論上，假設初始模板量為1個拷貝，酶的擴增效率100%，到達最大閾值約需要35個循環(huán)，因此業(yè)內(nèi)通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%，達到1個拷貝模板的循環(huán)數(shù)可能會達到38或更高。當酶的效率更低或者存在抑制劑時，檢測到1拷貝模板的循環(huán)數(shù)的Ct值可能會更高。
初始模板核酸濃度≤1 copies/μL時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。
7、溫馨提示：
①、每個qPCR試劑盒在上市前通常會按照行業(yè)統(tǒng)一的標準進行各種指標的系統(tǒng)評估，試劑盒生產(chǎn)企業(yè)通常會提供這些參數(shù)供客戶進行選擇和驗證。檢測實驗室均具備對試劑盒進行性能驗證的能力。
②、一個qPCR試劑盒的核心是引物探針設計、酶、反應體系和最優(yōu)的反應條件，qPCR產(chǎn)品的銷售推廣工作，對營銷服務人員要求技術(shù)較高，方可規(guī)避誤導推廣。
③、對于檢測來說，qPCR試劑盒只是其中的一個環(huán)節(jié)。如果想得到可靠的檢測結(jié)果，還需要對采樣、運輸、保存、處理、提取和擴增的每個環(huán)節(jié)，進行質(zhì)量控制（檢測全流程質(zhì)量控制）。實驗室檢測人員也不能持有，解決了qPCR試劑盒的問題就解決了檢測中所有問題的非理性觀點。
1、Ct值的基本概念
閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越��；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
2、Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內(nèi)，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數(shù)定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數(shù)小于1，可認為無意義。
3、Ct值的影響因素
由擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系：擴增產(chǎn)物量=起始模板量×（1+En）循環(huán)個數(shù)，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產(chǎn)生影響。模板質(zhì)量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。
擴增效率Efficiency (En):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
4、與Ct值有關(guān)的參數(shù)
標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。
相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。
擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。
5、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系
理想情況下，qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進行指數(shù)擴增，擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環(huán)數(shù)n。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結(jié)果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。
用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結(jié)果。
6、qPCR中Ct值的幾點思考
①、Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？
通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質(zhì)等定量準確的物質(zhì)（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結(jié)果仍存在一定的誤差。
②、熒光定量PCR是否為定量方法？
雖然名字里有“定量”，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，并不絕對準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。
③、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？
qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（最低檢測限），分析特異性（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優(yōu)劣并不夠科學，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環(huán)的預擴增，再進行正式循環(huán)的做法就是為了使Ct值看起來更低。
④、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？
不能！
理論上，假設初始模板量為1個拷貝，酶的擴增效率100%，到達最大閾值約需要35個循環(huán)，因此業(yè)內(nèi)通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%，達到1個拷貝模板的循環(huán)數(shù)可能會達到38或更高。當酶的效率更低或者存在抑制劑時，檢測到1拷貝模板的循環(huán)數(shù)的Ct值可能會更高。
初始模板核酸濃度≤1 copies/μL時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。
7、溫馨提示：
①、每個qPCR試劑盒在上市前通常會按照行業(yè)統(tǒng)一的標準進行各種指標的系統(tǒng)評估，試劑盒生產(chǎn)企業(yè)通常會提供這些參數(shù)供客戶進行選擇和驗證。檢測實驗室均具備對試劑盒進行性能驗證的能力。
②、一個qPCR試劑盒的核心是引物探針設計、酶、反應體系和最優(yōu)的反應條件，qPCR產(chǎn)品的銷售推廣工作，對營銷服務人員要求技術(shù)較高，方可規(guī)避誤導推廣。
③、對于檢測來說，qPCR試劑盒只是其中的一個環(huán)節(jié)。如果想得到可靠的檢測結(jié)果，還需要對采樣、運輸、保存、處理、提取和擴增的每個環(huán)節(jié)，進行質(zhì)量控制（檢測全流程質(zhì)量控制）。實驗室檢測人員也不能持有，解決了qPCR試劑盒的問題就解決了檢測中所有問題的非理性觀點。
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