RT-PCR實驗RNA提取及質(zhì)量確認方法盤點
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
RNA提取：
1. 收集目的菌體；
2. 研缽置于180℃烘箱3小時，備用；
3. 采用液氮低溫研磨15分鐘至菌體破碎，可通過鏡檢查看菌體破碎效果，該過程避免破碎時間過久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混勻后轉(zhuǎn)移至RNase free的EP管中；
5. 在每管樣品中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s后，室溫放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C離心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的無水乙醇，吹打混勻；
8. 將上述700 μL混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000 rpm離心30 s，棄廢液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液；
10. 重復步驟9；
11. 12000 rpm離心2 min后，把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的EP管；
12. 開蓋后，室溫放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，靜置1分鐘；
14. 12000 rpm，4℃離心1 min，將含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后續(xù)的濃度測定以及質(zhì)量檢測，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，備用。
RT-PCR實驗RNA的質(zhì)量確認方法：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3、保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續(xù)的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗基本上就成功了！
RNA提取：
1. 收集目的菌體；
2. 研缽置于180℃烘箱3小時，備用；
3. 采用液氮低溫研磨15分鐘至菌體破碎，可通過鏡檢查看菌體破碎效果，該過程避免破碎時間過久；
4. 吸取1 mL Trizol，充分混勻后轉(zhuǎn)移至RNase free的EP管中；
5. 在每管樣品中加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s后，室溫放置2 min；
6. 12000 rpm，4°C離心10 min，吸取350 μL上清液到新的RNase free EP管；
7. 加入350 μL 70% 的無水乙醇，吹打混勻；
8. 將上述700 μL混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000 rpm離心30 s，棄廢液；
9. 吸取700 μL的RW1到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液吸取500 μL 的RW2到吸附柱中, 12000 rpm離心30 s，棄廢液；
10. 重復步驟9；
11. 12000 rpm離心2 min后，把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的EP管；
12. 開蓋后，室溫放置5 min晾干；
13. 在吸附柱中添加60 μL RNase free的水，靜置1分鐘；
14. 12000 rpm，4℃離心1 min，將含有RNA溶液的EP管迅速置于冰上，防止降解；
取出5 μL的RNA溶液，用于后續(xù)的濃度測定以及質(zhì)量檢測，余下的RNA溶液在-80°C冰箱中保存，備用。
RT-PCR實驗RNA的質(zhì)量確認方法：
1、檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。
如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據(jù)我的經(jīng)驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續(xù)的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3、保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續(xù)的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗基本上就成功了！
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