導致ELISA實驗出現(xiàn)假陽性結果的因素匯集
ELISA是一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的一種酶聯(lián)免疫技術檢測方法。用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原(或抗體)。即用酶標記抗體，并將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相載體表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結果。下面分享導致ELISA實驗假陽性五大因素！
一、內(nèi)源性因素1、年齡因素
老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測的結果出現(xiàn)假陽性。
2、疾病因素
類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體，自身抗體、類風濕因子等，這些特殊成分在反應過程中有一定的吸附作用，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應而出現(xiàn)假陽性。
二、標本因素
1、標本處理不徹底
血液抽出后未完全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原完全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不徹底干凈，酶殘留在反應孔中，使反應孔吸光度值偏高，出現(xiàn)假陽性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速（3000/min）和較長的離心時間（>10/min）之上，血液標本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質(zhì)對試驗結果的影響。
2、標本溶血
標本溶血時細胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結合，洗滌時不易洗去，催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應，使本底吸光度值偏高形成假陽性。
3、細菌污染
標本放置、處置不當被細菌污染，一些細菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會對相應的酶做標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應。
三、操作因素
1、加樣
對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數(shù)大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標本，可較好地避免以上誤差。
2、洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關鍵一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)
3、溫育
每種試劑都有其最合適的反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應加蓋。
四、儀器因素
1、酶標儀
作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩(wěn)定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養(yǎng)，對濾光片要定期校正；其次酶標儀波長設置要正確，最好使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數(shù)時最好先擦拭微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書。
2、波長選擇
酶標儀的波長選擇，建議酶標儀比色時選擇雙波長，即敏感波長（主波長）和非敏感干擾波長（次波長），最后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長與非敏感干擾波長之差，排除（板孔的劃痕、污跡）干擾。
五、方法學因素
1、試劑盒選擇
由于不同廠家的試劑盒所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性或假陰性的產(chǎn)生。實驗中，不同廠家的ELISA試劑盒不要混用。
2、實驗灰區(qū)
在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值（cut-off）來判定結果，一般把檢測值S/COV值（樣本吸光度值比臨界值）在0.6-1范圍內(nèi)時作為灰區(qū)帶，因此當1＜S /CO≤0.6時，真反應性顯色的可能性小，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致，實驗室檢測人員應依據(jù)實驗檢測結果，結合受檢者相應病史和個體狀況進行綜合分析，應進行確認實驗，避免判定假陽性。
3、鉤狀效應
鉤狀效應即HOOK效應,是指由于抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過量叫做前帶效應；抗原過量叫做后帶效應。鉤狀效應的產(chǎn)生，需對標本進行稀釋重復檢測。
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