目前，100%的病死率和病毒株的交叉感染使ASFV對社會的危害不斷擴大。由于缺乏有效的商業(yè)疫苗，早期發(fā)現(xiàn)是遏制ASFV感染的最有效手段。
近期，山東師范大學(xué)在Biosensors and Bioelectronics發(fā)表了一篇《Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor》，該文章報告了一個基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)結(jié)合石墨烯場效應(yīng)晶體管傳感器的級聯(lián)檢測平臺。
CRISPR-Cas12a級聯(lián)平臺的工作原理是基于RNA導(dǎo)向的DNA切割機制，通過選擇性識別和切割特定的DNA序列，實現(xiàn)基因組的精確編輯。具體來說，在缺乏目標(biāo)DNA的情況下，crRNA與Cas12a結(jié)合形成RNP。當(dāng)crRNA識別目標(biāo)DNA時，CRISPR-Cas12a的非特異性DNA切割活性被激活。
為了提高信號產(chǎn)生的效率，該平臺采用了特殊的報告探針(RP)設(shè)計，由靠近石墨烯的6T和遠(yuǎn)離石墨烯的12U組成。這種設(shè)計使得如果一個脫氧核糖核苷酸被降解，至少有12個核苷酸會從石墨烯表面分離，顯著提高信號產(chǎn)生效率。然而，該級聯(lián)平臺中的RP被固定在石墨烯表面，替代傳統(tǒng)RP傳感器通常分散在溶液系統(tǒng)中，這使得RP可以被激活的CRISPR-Cas12a更強烈地降解。     另外，這個平臺還采用了ASFV P72基因中的10個crRNA特異性位點進(jìn)行優(yōu)化，以實現(xiàn)對ASFV更靈敏的檢測。這些crRNA可以識別不同的位點，并激活Cas12a蛋白的剪切活性。通過在單個長靶上設(shè)置多個可以識別不同位點的crRNA，可以顯著提高靶向Cas12a蛋白的激活效率。實驗結(jié)果表明，Real-time熒光檢測限為100 fM，靈敏度不足以實現(xiàn)ASFV病毒檢測的臨床應(yīng)用。因此，探索如何使CRISPR-Cas12a系統(tǒng)對ASFV檢測更加靈敏是必要的，并成為研究熱點。
接著，作者對不同條件下的電導(dǎo)率進(jìn)行測試，實驗表明：石墨烯的電導(dǎo)率對外源摻雜敏感，經(jīng)PBASE處理的石墨烯與RP/PBASE處理的石墨烯差異較大，使得實驗結(jié)果更容易識別。    
  緊接著，作者測試了該平臺的檢測靈敏度與特異性，發(fā)現(xiàn)ASFV-P72基因在0.1 aM ~ 100 aM濃度范圍內(nèi)通過級聯(lián)平臺進(jìn)行檢測，成功檢測到濃度低至0.5 aM的靶標(biāo)，高于Real-time PCR的最低檢測限10aM。且除ASFV外，所有病毒均引起狄拉克斑點向左移動，顯示了級聯(lián)平臺的特異性。    
 
最后，作者對12例ASFV陽性樣本和4例陰性樣本進(jìn)行傳感器檢測，陽性樣本出現(xiàn)高強度右移特征響應(yīng)，表明平臺具有良好可靠性；陰性樣本出現(xiàn)左移狄拉克點變化響應(yīng)，表明平臺具有良好的特異性。與已發(fā)表的研究成果相比，該平臺對ASFV臨床樣本的檢測時間最短，靈敏度最高。采用4個ASFV模擬樣本進(jìn)行分型試驗，當(dāng)模擬樣品中僅存在P72基因時，添加新的crRNA不會改變斜率；當(dāng)存在CD2V基因時，添加crRNA-CD2V會增加斜率；同樣，當(dāng)存在MGF基因時，添加crRNA-MGF也會導(dǎo)致斜率增大。通過觀察特定應(yīng)變類型的crRNA加入后斜率是否發(fā)生變化，成功進(jìn)行了應(yīng)變分型。    
   
點評：該級聯(lián)平臺可在30分鐘內(nèi)檢測到低至0.5 aM的ASFV，并在單一檢測系統(tǒng)中實現(xiàn)ASFV野生株和疫苗株的分型。對16份臨床樣本的評價證明，該平臺與金標(biāo)準(zhǔn)Real-time PCR方法相比，靈敏度、特異性和分型方面具有突出的優(yōu)勢。該級聯(lián)平臺結(jié)合CRISPR/Cas12a的高特異性和石墨烯場效應(yīng)晶體管的雙極電場效應(yīng)，與已發(fā)表的研究成果相比，本文提出的傳感器對ASFV臨床樣本的檢測時間最短，靈敏度最高，有望在DNA疾病檢測領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)臨床應(yīng)用，為多品系疾病分型提供新的方向。    

文章來源：Wang H, Sun Y, Zhou Y, et al. Unamplified system for sensitive and typing detection of ASFV by the cascade platform that CRISPR-Cas12a combined with graphene field-effect transistor. Biosens Bioelectron. 2023;240:115637. doi:10.1016/j.bios.2023.115637