關(guān)節(jié)骨軟骨單元由關(guān)節(jié)軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨三部分組成，具有復雜的軟骨-骨界面，且不同組織層之間的特性不同。由于很難誘導間充質(zhì)干細胞（MSC）向軟骨和骨進行定向的可控分化，因此骨軟骨單元的再生一直頗具挑戰(zhàn)性。

近年來，類器官（organoids）技術(shù)迅速發(fā)展，為骨軟骨再生提供了新的機會。然而，目前的主要局限是單一的支架和特定的培養(yǎng)基無法培養(yǎng)出具有異質(zhì)性結(jié)構(gòu)的類器官。采用其他方法嘗試加入誘導生長因子，以誘導間充質(zhì)干細胞定向分化，但也面臨著實驗成本高、細胞易失活等問題。

對此，北京大學人民醫(yī)院和清華大學領導的研究團隊利用定制的微凝膠開發(fā)出一種自組裝的類器官，用于骨軟骨再生。這種類器官呈現(xiàn)出分層組織結(jié)構(gòu)，且無需使用大塊支架或生長因子。這項成果已發(fā)表在《Bioactive Materials》雜志上，為推進組織工程領域的發(fā)展開辟了一條大有潛力的新途徑。
 

^{01 研究材料和方法}
研究材料和方法
研究人員設計并構(gòu)建了透明質(zhì)酸和羥基磷灰石修飾的明膠基微凝膠，之后將MSC（人臍帶間充質(zhì)干細胞）接種到這些定制的微凝膠中，誘導其分化為軟骨細胞和骨細胞（成軟骨誘導培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基由賽業(yè)OriCell^®提供），之后通過自組裝形成骨軟骨類器官。然后通過掃描電鏡、qRT-PCR、mRNA-seq等方法對骨軟骨類器官進行了體外分析。最后將預分化的微凝膠注入比格犬的骨軟骨缺損處，在術(shù)后3個月和6個月對所有膝關(guān)節(jié)進行采集分析。

技術(shù)路線
1.制備CH-微凝膠和OS-微凝膠，將MSC接種到這些微凝膠中，誘導其分化為軟骨細胞和骨細胞。
2.將預分化的成軟骨和成骨微凝膠依次沉積為兩層，通過自我組裝形成骨軟骨類器官。
3.通過mRNA-seq分析確定微凝膠中的MSC定向分化為軟骨細胞和骨細胞的機制。
4.將預分化的微凝膠依次注射到比格犬的骨軟骨缺損處，評估骨軟骨類器官的體內(nèi)修復能力。
 

02 研究結(jié)果 

定制微凝膠的制備思路
前期研究發(fā)現(xiàn)，可注射的微凝膠（microcryogels）提供了一種3D微環(huán)境，可用來加載基質(zhì)、細胞和生物活性因子，為各種實驗模型的組織修復創(chuàng)造量身定制的細胞生態(tài)位。含有MSC的微凝膠可通過自我組裝形成3D功能組織，提高MSC的干性和旁分泌活性。為了進一步改善MSC微凝膠中細胞的成軟骨表型，研究人員故決定采用化學交聯(lián)策略。

為了給MSC的成軟骨分化和成骨分化提供合適的微環(huán)境，研究人員在基于明膠的前體溶液中分別加入透明質(zhì)酸（HA）和羥基磷灰石（HYP），經(jīng)過冷凍、鋪板、洗滌和凍干后形成CH-微凝膠（用于成軟骨分化）和OS-微凝膠（用于成骨分化）。之后將MSC接種到這些定制的CH-微凝膠和OS-微凝膠中，分別在成軟骨誘導培養(yǎng)基和成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，再將預分化的成軟骨和成骨微凝膠依次沉積為兩層，通過自我組裝形成骨軟骨類器官（圖1）。
 

定制微凝膠的制備示意圖^[1]

將定制微凝膠自組裝成骨軟骨類器官
在自組裝之前，研究人員首先評估了定制微凝膠中的成軟骨和成骨分化。染色結(jié)果顯示，與對照微凝膠相比，CH-微凝膠誘導成軟骨分化的能力更強，而OS-微凝膠具有很強的促成骨分化的能力。CH-微凝膠中的成軟骨標志物（COL2和SOX9）表達量較高，OS-微凝膠中的RUNX2基因表達量較高，但其他成骨分化基因（COL1、OCN和ALP）的表達量并無差異。

之后，研究人員將預分化的微凝膠移入邊長4mm的網(wǎng)狀框架內(nèi)，并在骨軟骨誘導混合培養(yǎng)基（成軟骨分化：成骨分化=1:1）中培養(yǎng)7天。在預分化的微凝膠自組裝成骨軟骨類器官后，研究人員開展了體外分析（圖2）。掃描電鏡成像結(jié)果顯示，整個類器官呈多孔結(jié)構(gòu)，軟骨成分和骨成分之間的界面整合良好。細胞追蹤顯示，自組裝的類器官包含兩層細胞，分別位于CH-微凝膠和OS-微凝膠中，這兩層細胞很好地整合在一起，沒有融合成一團細胞。有趣的是，兩種定制微凝膠促進血管生成的能力不同。CH-微凝膠中沒有新生血管，而OS-微凝膠中有許多血管生長，表明OS-微凝膠有更好的促進血管生成的潛力。
 

骨軟骨類器官的體外自組裝^[1]

定制微凝膠指導MSC的命運
接下來，研究人員對定制微凝膠開展了mRNA-seq分析，以揭示其指導MSC命運的機制。在成軟骨誘導7天后，研究人員比較了在對照微凝膠和CH-微凝膠中生長的MSC，總共發(fā)現(xiàn)了4408個差異表達基因（DEG）。為了更好地了解參與軟骨再生的DEG的基因功能，再將其分為軟骨細胞調(diào)節(jié)和免疫調(diào)控。結(jié)果顯示，與軟骨細胞增殖相關(guān)的基因顯著上調(diào)，而與免疫反應相關(guān)的基因則下調(diào)，包括對IL-1的反應、白細胞遷移、炎癥反應調(diào)節(jié)和T細胞介導的免疫等。KEGG富集分析顯示，3條通路上調(diào)（包括hedgehog、rap1和p53通路），8條與免疫調(diào)控和軟骨細胞肥大相關(guān)的通路下調(diào)，表明CH-微凝膠能夠促進成軟骨分化并抑制炎癥。

同樣地，在成骨誘導7天后，研究人員比較了在對照微凝膠和OS-微凝膠中生長的MSC。研究人員共分析了2158個下調(diào)DEG和3213個上調(diào)DEG。GO分析表明上調(diào)的基因與成骨細胞分化、骨化、骨發(fā)育、骨生長和骨礦化相關(guān)。KEGG分析顯示，與骨發(fā)育相關(guān)的通路（包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt通路）和免疫調(diào)控相關(guān)通路（mTOR、TNF和IL-17通路）顯著上調(diào)，而與細胞凋亡相關(guān)的p53信號通路則顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，OS-微凝膠能夠促進成骨分化并抑制免疫反應。

利用自組裝骨軟骨類器官來治療體內(nèi)骨軟骨缺損
之后，研究人員利用比格犬股骨滑車缺損模型，測試了自組裝形成的骨軟骨類器官在治療體內(nèi)骨軟骨缺損上的效果。他們將預分化的定制微凝膠依次注入比格犬的骨軟骨缺損處，在原位自組裝形成骨軟骨類器官，并在術(shù)后3個月和6個月對所有膝關(guān)節(jié)進行采集分析（圖3）。術(shù)后6個月，對照組的比格犬明顯跛行，但微凝膠治療組的比格犬在步態(tài)上明顯改善，僅有輕微跛行。核磁共振圖像顯示，術(shù)后3個月和6個月時都存在修復組織（如紅色箭頭所示）。

在術(shù)后3個月，觀察骨軟骨缺損處的修復組織，發(fā)現(xiàn)未治療對照組和對照微凝膠組幾乎沒有軟骨樣組織生長，對于骨軟骨類器官組，缺損修復的情況要好得多，但新生組織的外觀和平整度仍不如正常軟骨。術(shù)后6個月，對照微凝膠組的大部分缺損已被填充，但修復組織的外觀不平整。而在骨軟骨類器官組中，新生組織表現(xiàn)出閃亮且光滑的表面，與周圍的軟骨很好地整合，沒有明顯的邊界。組織學評估的結(jié)果也表明，骨軟骨類器官組的缺損再生效果優(yōu)于其他兩組。
 

對原位自組裝類器官的骨軟骨再生進行體內(nèi)分析^[1]

^{03 研究結(jié)論}

研究人員此次開發(fā)出一種新方法，通過設計定制的微凝膠來分別指導MSC命運，從而構(gòu)建骨軟骨類器官。這些定制的微凝膠顯示出良好的細胞相容性以及誘導MSC分化成軟骨細胞和骨細胞的強大能力。在體內(nèi)依次注射定制的微凝膠，可在原位自組裝形成骨軟骨類器官，實現(xiàn)軟骨和軟骨下骨的同時再生。這種策略有望實現(xiàn)界面組織的有效再生，而無需采用復雜或嚴苛的制造工藝。
 

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