細(xì)胞培養(yǎng)中污染源及對(duì)應(yīng)解決方法總結(jié)
細(xì)胞培養(yǎng)是從生物體中取出細(xì)胞，使其在合適的人工環(huán)境中（模擬體內(nèi)）生長(zhǎng)和擴(kuò)繁。細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有細(xì)菌污染、霉菌污染、支原體污染、黑膠蟲污染、真菌污染、原蟲污染等。它們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)中污染情況以及相應(yīng)的解決方法如下：
1、細(xì)菌：
細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。
解決方法：仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理，如四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素。
2、霉菌：
培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差。
解決方法：用硫酸銅溶液擦拭CO₂孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅�；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO₂孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個(gè)別污染，可能是操作問題，就要注意操作。
3、支原體：
黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
解決方法：支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒有細(xì)胞壁，故作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素等是不敏感的；對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對(duì)支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法對(duì)支原體是沒有作用的。
4、黑蛟蟲：
可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
解決方法：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
5、真菌：
一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
解決方法：果斷扔掉，然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間，CO₂孵箱，器皿和培養(yǎng)液。
6、原蟲：
培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終形成惡性循環(huán)。
解決方法：污染的可能原因很多，比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等，如果細(xì)胞很多的話，直接扔了重新復(fù)蘇細(xì)胞，如果是保種細(xì)胞的話，可購(gòu)買相關(guān)的滅菌試劑。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等。
關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長(zhǎng) 就是操作的問題。
也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時(shí)會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測(cè)細(xì)胞某項(xiàng)指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時(shí)孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水
2、超凈臺(tái)\取材\器材\培養(yǎng)液\培養(yǎng)瓶\操作等因素
3、超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染
4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn)入操作。
1、細(xì)菌：
細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。
解決方法：仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理，如四環(huán)素，慶大霉素，或者鏈霉素。
2、霉菌：
培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差。
解決方法：用硫酸銅溶液擦拭CO₂孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅�；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO₂孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個(gè)別污染，可能是操作問題，就要注意操作。
3、支原體：
黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
解決方法：支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒有細(xì)胞壁，故作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素等是不敏感的；對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對(duì)支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法對(duì)支原體是沒有作用的。
4、黑蛟蟲：
可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。
解決方法：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
5、真菌：
一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
解決方法：果斷扔掉，然后徹底消毒滅菌培養(yǎng)間，CO₂孵箱，器皿和培養(yǎng)液。
6、原蟲：
培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終形成惡性循環(huán)。
解決方法：污染的可能原因很多，比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等，如果細(xì)胞很多的話，直接扔了重新復(fù)蘇細(xì)胞，如果是保種細(xì)胞的話，可購(gòu)買相關(guān)的滅菌試劑。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等。
關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長(zhǎng) 就是操作的問題。
也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時(shí)會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測(cè)細(xì)胞某項(xiàng)指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時(shí)孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水
2、超凈臺(tái)\取材\器材\培養(yǎng)液\培養(yǎng)瓶\操作等因素
3、超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染
4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn)入操作。
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