ELISA實驗的不同常規(guī)樣本處理方法介紹
常規(guī)用于ELISA實驗的樣本包含血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、尿液以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法存在差異，合適的樣本預(yù)處理是確保ELISA實驗正確性和準確性的第一步。這里，將介紹幾種不同樣本類型的處理方法。
1. 血清
血清是ELISA實驗最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡單。
使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置2小時或4℃過夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來）。2-8℃下以1000×g離心20分鐘，小心收集上清液（血清），立即進行測定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實驗中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。另外，樣本還應(yīng)避免細菌污染，因為細菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。
2. 血漿
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃下以1000×g離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細胞培養(yǎng)上清
將細胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細胞提取液
反復(fù)凍融方法：
1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可以省略該步驟。
2） 將細胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞3次。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。在6孔培養(yǎng)板（約1×106個細胞）中，每個孔加入150-250μL的PBS來重懸細胞。
4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細胞完全裂解。也可以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細胞。
5） 2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
1） 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）。
2） 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。
4） 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃下以5000×g離心5分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
6. 唾液
在2-8℃下，4000×g離心10分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。建議使用新鮮的唾液樣本檢測。
7. 尿液
使用無菌容器收集尿液樣本。在2-8℃下，1000×g離心15分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。
8. 糞便
將糞便樣本用PBS(0.01M, pH=7.4)重懸,置于冰上振蕩15分鐘,然后在2-8℃，5000×g離心5分鐘，取上清即可檢測。
9. 其他生物體液請咨詢技術(shù)支持。
樣品注意事項：
1. 樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃(3個月內(nèi)檢測)，避免反復(fù)凍融。融化樣本在試驗前請再次離心以去除凍融后可能出現(xiàn)的沉淀物。
2. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議查閱文獻后先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。
3. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。
4. 若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。樣本中不能含有會抑制HRP活性的NaN3，否則會造成假陰性結(jié)果。
1. 血清
血清是ELISA實驗最常用的樣本，其預(yù)處理也十分簡單。
使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置2小時或4℃過夜，分離出血清（建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來）。2-8℃下以1000×g離心20分鐘，小心收集上清液（血清），立即進行測定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。
在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實驗中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。另外，樣本還應(yīng)避免細菌污染，因為細菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。
2. 血漿
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，2-8℃下以1000×g離心15分鐘，小心收集上清液（血漿）。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括EDTA鈉鹽，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細胞培養(yǎng)上清
將細胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
4. 細胞提取液
反復(fù)凍融方法：
1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可以省略該步驟。
2） 將細胞懸浮液收集到離心管中，在2-8℃下以1000×g離心5分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細胞3次。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。在6孔培養(yǎng)板（約1×106個細胞）中，每個孔加入150-250μL的PBS來重懸細胞。
4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細胞完全裂解。也可以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細胞。
5） 2-8℃下以1500×g離心10分鐘，去除細胞碎片，收集上清液，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
5. 組織勻漿
1） 用預(yù)冷的PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）。
2） 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
3） 加入適量的預(yù)冷PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑），用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。
4） 將勻漿液吸入離心管中，2-8℃下以5000×g離心5分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融。
6. 唾液
在2-8℃下，4000×g離心10分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。建議使用新鮮的唾液樣本檢測。
7. 尿液
使用無菌容器收集尿液樣本。在2-8℃下，1000×g離心15分鐘以去除雜質(zhì)，取上清即可檢測。
8. 糞便
將糞便樣本用PBS(0.01M, pH=7.4)重懸,置于冰上振蕩15分鐘,然后在2-8℃，5000×g離心5分鐘，取上清即可檢測。
9. 其他生物體液請咨詢技術(shù)支持。
樣品注意事項：
1. 樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測)，或-80℃(3個月內(nèi)檢測)，避免反復(fù)凍融。融化樣本在試驗前請再次離心以去除凍融后可能出現(xiàn)的沉淀物。
2. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議查閱文獻后先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。
3. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中，建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。
4. 若使用化學(xué)裂解液制備組織勻漿或細胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會導(dǎo)致ELISA測值出現(xiàn)偏差。樣本中不能含有會抑制HRP活性的NaN3，否則會造成假陰性結(jié)果。
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