將MANTIS®液體處理器集成到一個(gè)新的工作流程中，用于分析單細(xì)胞的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，使實(shí)驗(yàn)小型化

 

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)是一種用于研究單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的技術(shù)。與傳統(tǒng)的大群體測(cè)序不同，它強(qiáng)調(diào)了mRNA水平的細(xì)胞-細(xì)胞變異，更深入地了解健康和疾病的先決條件。scRNAseq的主要挑戰(zhàn)來(lái)自于單個(gè)細(xì)胞只包含少量的mRNA。從極其有限的材料中提取有意義的生物信息需要具有特殊靈敏度和重現(xiàn)性的scRNA-seq制備方法。

 

為了解決這一需求，Takara Bio的研究人員開發(fā)了SMART-Seq®單細(xì)胞試劑盒(SSsc)。SSsc通過(guò)直接從單個(gè)細(xì)胞中生成高質(zhì)量的全長(zhǎng)cDNA，僅用2pg的RNA就能提供敏感且高重復(fù)性的結(jié)果。最近，通過(guò)將FORMULATRIX®旗下MANTIS®液體處理器集成到SSsc工作流程中，可以在不影響產(chǎn)量、靈敏度、重復(fù)性的情況下將反應(yīng)體積縮小到原來(lái)的四分之一，進(jìn)一步增強(qiáng)了這種強(qiáng)大的新一代測(cè)序技術(shù)的實(shí)用性。

 

SMART-Seq®單細(xì)胞試劑盒技術(shù)的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)

 

與現(xiàn)有的用于制備scRNA-seq樣品的技術(shù)相比，SSsc有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。這包括優(yōu)越的靈敏度和重復(fù)性；一個(gè)簡(jiǎn)單的、模板化的工作流；以及不受小型化影響的強(qiáng)勁性能。

 

考慮到SSsc的靈敏性和重復(fù)性，Takara的研究人員已經(jīng)證明SSsc比廣泛使用的Smart-seq2技術(shù)檢測(cè)到更多的淋巴母細(xì)胞系 (GM12878)基因，同時(shí)斯皮爾曼相關(guān)性系數(shù)顯示SSsc具有更高的重復(fù)性( 圖 1 ) 。在此對(duì)比分析 中，SSsc方法具有良好的精度，沒有缺失值，在384個(gè)Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.133，在0.5個(gè)周期內(nèi)，99.5%的數(shù)據(jù)點(diǎn)都落在半圓內(nèi)。這種性能尤其對(duì)RNA含量極低的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序擁有極高的價(jià)值，它可以用來(lái)識(shí)別罕見的基因或檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

圖1:SMART-Seq®單細(xì)胞試劑盒優(yōu)于Smart-seq2。采用SSsc(18個(gè)細(xì)胞)或Smartseq2 (20個(gè)細(xì)胞; Picelli et al. 20141) 對(duì)淋巴母細(xì)胞系(GM12878)基因的gle細(xì)胞進(jìn)行19個(gè)周期的PCR處理。如上所述，生成RNA-seq庫(kù)，將所有樣本標(biāo)準(zhǔn)化至175萬(wàn)雙端reads后，分析se-quences。圖a是在處理SSsc的細(xì)胞中檢測(cè)到的更多基因。圖B相關(guān)箱形圖顯示SSsc處理的細(xì)胞之間具有更高的斯皮爾曼相關(guān)性，這表明與Smartseq2相比具有更高的重復(fù)性。

 

一個(gè)簡(jiǎn)單的、模板化的工作流

 

SMART-Seq®單細(xì)胞試劑盒采用了一個(gè)簡(jiǎn)單的、模板化的工作流程，包括將細(xì)胞分配到預(yù)先準(zhǔn)備的孔板上，反向轉(zhuǎn)錄RNA，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的cDNA；然后在定量或者庫(kù)準(zhǔn)備之前對(duì)其進(jìn)行純化。圖2總結(jié)了原始的、完整工作流程，橙色標(biāo)記出了轉(zhuǎn)移到MANTIS液體處理器上完成的步驟。

圖2：SSsc工作流。使用MANTIS®液體處理器進(jìn)行的步驟以橙色顯示。

 

使用MANTIS®液體處理器，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)健實(shí)驗(yàn)的小型化

 

通過(guò)將MANTIS®液體處理器引入SSsc工作流程，Takara的研究人員已經(jīng)能夠自動(dòng)化三個(gè)關(guān)鍵的步驟：孔板制備、添加RT master mix、添加PCR master mix，如圖2所示。這不僅提高了工作流效率，而且還使SSsc工藝能夠轉(zhuǎn)移到384孔板上，從而使反應(yīng)體積減少到四分之一，獲得更高、更有價(jià)值的靈敏度。

圖3:MANTIS®顯示移液管尖端通過(guò)小管連接到高容量(HV)芯片上。

 

使用MANTIS液體處理器運(yùn)行的全體積 和四分之一體積SSsc工作流的性能類如 圖4所示。在這兩種情況下，每個(gè)細(xì)胞大約產(chǎn)生60-80 ng的cDNA，鑒定出的基因數(shù)量相似。從圖5中可以看出，降低整體體積并沒有降低靈敏度或重復(fù)性，強(qiáng)調(diào)了SSsc與小型化的兼容性。

 

四份已經(jīng)詳細(xì)制定的實(shí)驗(yàn)方案，規(guī)定了在MANTIS液體處理器上執(zhí)行SSsc配件的分步工作流程，描述了96孔板中的全體積、半體積和四分之一體積反應(yīng)大小，以及384孔板中的四分之一體積反應(yīng)大小。這些實(shí)驗(yàn)方案可從FORMULATRIX網(wǎng)站下載。

  

圖4:使用MANTIS®液體處理器進(jìn)行全體積和四分之一體積移液的工作流程的相似產(chǎn)量和靈敏度。

 

圖5:組內(nèi)Pearson(圖A)或Spearman(圖B)在全體積或四分之一體積下處理的所有細(xì)胞之間的相關(guān)性表明，重復(fù)性和靈敏度不會(huì)因體積減少而受到影響。

 

SMART-Seq®單細(xì)胞試劑盒為進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析提供了許多好處，這種有價(jià)值的新一代測(cè)序技術(shù)的范圍可以通過(guò)集成MANTIS液體處理器到SSsc工作流程，進(jìn)一步擴(kuò)展。通過(guò)將SSsc的靈敏度和重復(fù)性與MANTIS液體處理器提供的樣品處理效率、更小的反應(yīng)體積相結(jié)合，研究人員可以實(shí)現(xiàn)對(duì)珍貴樣品材料越來(lái)越詳細(xì)的表征。

 

可以從FORMULATRIX網(wǎng)站的參考資料頁(yè)面下載使用Smart-Seq®單細(xì)胞試劑盒在MANTIS液體處理器上的全體積、半體積、四分之一體積和384-孔板四分之一體積的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟。