蛋白質(zhì)免疫印跡法WB標(biāo)準(zhǔn)流程詳解
Western Blot（WB）又稱蛋白質(zhì)免疫印跡法，是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過顯色技術(shù)檢測目的蛋白的技術(shù)。
Western-Blotting的標(biāo)準(zhǔn)流程（protocol）如下：
1、細(xì)胞及組織收集；
2、細(xì)胞/組織裂解及蛋白定量；
3、SDS-PAGE凝膠制備；
tips：筆者經(jīng)驗是在裂解細(xì)胞/組織（30min）的同時配制SDS-PAGE的下層膠，待細(xì)胞理解完成可離心收集裂解液上清（4℃，10-15min），離心同時可配制SDS-PAGE上層膠，待上層膠凝固過程中可進(jìn)行蛋白定量。
4、蛋白電泳：
a、組裝SDS-PAGE：將配制好的SDS-PAGE膠組裝在Western-Blotting電泳系統(tǒng)中(注意厚玻璃板稍高、靠外放置，薄玻璃板稍矮、靠內(nèi)放置，水平放置時厚板在下、薄板在上記為正面）；
b、蛋白上樣：加入電泳緩沖液，每孔上樣量為10-20 μL（蛋白總量10-20ug即可），蛋白marker上樣3-5 μL（注意保證上樣體積盡量一致，否則可能導(dǎo)致蛋白條帶不在同一水平線；上樣時可用10 μL移液器緩慢滴加，切忌快速吹打以免引起蛋白樣品溢出，此外，上樣體積最好不要接近上樣孔的總體積，筆者經(jīng)驗10孔板每孔上樣體積不宜超過40 μL，15孔板上樣體積不宜超過25 μL；當(dāng)然，上樣孔的總體積大于上述數(shù)值）；
c、接通電源、開始電泳：80 V電泳50 min，待蛋白marker到達(dá)分離膠改用120 V電泳2 h至蛋白marker到達(dá)分離膠底部，停止電泳（電泳參數(shù)不同實驗室習(xí)慣不一，也可一段式即無需調(diào)整電壓；大多數(shù)實驗室多采用兩段式：低電壓80V左右緩慢電泳壓平樣品，稍高電壓120V左右快速分離分子量不同的蛋白）；
tips：一般來說電泳液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，方便糾錯；但是大多數(shù)研究者的經(jīng)驗式，電泳液可反復(fù)使用，內(nèi)槽一般選用新鮮電泳液，外槽可選用回收電泳液，外槽電泳液高度一般無特殊要求，有的研究者習(xí)慣外槽電泳液高度顯著低于內(nèi)槽電泳液高度，造成所謂“電勢差”，筆者經(jīng)驗這種電勢差對電泳時間和WB結(jié)果無明顯影響；此外，有研究者會疑惑電泳液可重復(fù)使用多少次，筆者經(jīng)驗是n次，n≥10，均不影響實驗結(jié)果。
5、轉(zhuǎn)膜：
小心撬開電泳凝膠板，裁取整塊分離膠并放入預(yù)冷的濕轉(zhuǎn)緩沖液，選取大小適當(dāng)?shù)腘C膜，按“三明治”的形式從上到下依次擺放2層海綿、2張濾紙、分離膠、NC膜（或PVDF膜）、2張濾紙、2層海綿，組裝濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，灌滿預(yù)冷1× 濕轉(zhuǎn)緩沖液，沒過“三明治”，室溫100 V濕轉(zhuǎn)60 min；
tips：a、濕轉(zhuǎn)液需提前預(yù)冷，筆者習(xí)慣電泳開始時將濕轉(zhuǎn)液置入制冰器或者-20℃冰箱；b、轉(zhuǎn)模時最好整塊分離膠轉(zhuǎn)膜，以免裁膠時丟失部分蛋白；c、做“三明治”的基本原則是“黑膠白膜”，即分離膠貼近濕轉(zhuǎn)夾黑色面、NC膜貼近濕轉(zhuǎn)夾白色面（或紅色面）；d、在制備“三明治”時，筆者習(xí)慣膜在下方、膠在上方，如此蛋白條帶順序和SDS-PAGE正面時的上樣順序完全一致，方便記憶；e、濕轉(zhuǎn)液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，但也可重復(fù)使用，pubmed有團(tuán)隊證實濕轉(zhuǎn)液可重復(fù)使用5次，而不明顯影響實驗結(jié)果；f、濕轉(zhuǎn)時，最好在冰箱/冷室（cold room）或者置于冰盒中，在電泳時間小于1h時，筆者習(xí)慣預(yù)冷濕轉(zhuǎn)液、室溫轉(zhuǎn)膜；g、濕轉(zhuǎn)條件亦有選擇恒流的，比如200mA，2h等，筆者所使用的濕轉(zhuǎn)條件對分子量為15-140kd的蛋白均適用；h、PVDF膜需用甲醇預(yù)激（數(shù)秒鐘即可），使得PVDF帶正電，能更好地與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合，而NC膜無需預(yù)處理;i、制作“三明治”時注意排除SDS-PAGE膠與NC膜之間的氣泡。
6、封閉蛋白抗原
利用0.1% TBST配制10%脫脂牛奶，將NC膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出，并用0.1% TBST潤洗2-3次，每次5 min，加入適量脫脂牛奶，室溫?fù)u床上封閉60 min（封閉用牛奶、BSA或者封閉液均可回收，4℃保存，反復(fù)使用數(shù)次）；
7、抗原抗體反應(yīng)：
a. 0.1% TBST潤洗封閉后的NC膜3次，每次5 min；
b. 稀釋一抗：稀釋液通常為脫脂牛奶或0.1% TBST，比例通常為1：1000（稀釋比例參見抗體說明書）；
c. 孵育一抗：4 ℃下?lián)u床，過夜封閉；
d. 回收一抗，-20℃保存供重復(fù)使用，0.1% TBST潤洗NC膜3次，每次5 min；
e. 孵育二抗：0.1% TBST稀釋HRP標(biāo)記的對應(yīng)種屬的二抗，比例為1：5000-1：10000，室溫下?lián)u床孵育60 min；
f. 0.1% TBST潤洗NC膜3次，每次10 min；
tips：抗體孵育條件、時間等詳見《【W(wǎng)estern-Blotting】WB核心理論：抗原抗體特異性反應(yīng)》；
8、顯色
按1：1的比例將ECL發(fā)光劑中A液和B液混勻，轉(zhuǎn)有蛋白面的NC膜貼敷ECL發(fā)光液，室溫下反應(yīng)2 min，吸干ECL發(fā)光液，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影及膠片掃描（國內(nèi)較常用的是化學(xué)發(fā)光儀，但敏感性不如膠片曝光）。
Western-Blotting的標(biāo)準(zhǔn)流程（protocol）如下：
1、細(xì)胞及組織收集；
2、細(xì)胞/組織裂解及蛋白定量；
3、SDS-PAGE凝膠制備；
tips：筆者經(jīng)驗是在裂解細(xì)胞/組織（30min）的同時配制SDS-PAGE的下層膠，待細(xì)胞理解完成可離心收集裂解液上清（4℃，10-15min），離心同時可配制SDS-PAGE上層膠，待上層膠凝固過程中可進(jìn)行蛋白定量。
4、蛋白電泳：
a、組裝SDS-PAGE：將配制好的SDS-PAGE膠組裝在Western-Blotting電泳系統(tǒng)中(注意厚玻璃板稍高、靠外放置，薄玻璃板稍矮、靠內(nèi)放置，水平放置時厚板在下、薄板在上記為正面）；
b、蛋白上樣：加入電泳緩沖液，每孔上樣量為10-20 μL（蛋白總量10-20ug即可），蛋白marker上樣3-5 μL（注意保證上樣體積盡量一致，否則可能導(dǎo)致蛋白條帶不在同一水平線；上樣時可用10 μL移液器緩慢滴加，切忌快速吹打以免引起蛋白樣品溢出，此外，上樣體積最好不要接近上樣孔的總體積，筆者經(jīng)驗10孔板每孔上樣體積不宜超過40 μL，15孔板上樣體積不宜超過25 μL；當(dāng)然，上樣孔的總體積大于上述數(shù)值）；
c、接通電源、開始電泳：80 V電泳50 min，待蛋白marker到達(dá)分離膠改用120 V電泳2 h至蛋白marker到達(dá)分離膠底部，停止電泳（電泳參數(shù)不同實驗室習(xí)慣不一，也可一段式即無需調(diào)整電壓；大多數(shù)實驗室多采用兩段式：低電壓80V左右緩慢電泳壓平樣品，稍高電壓120V左右快速分離分子量不同的蛋白）；
tips：一般來說電泳液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，方便糾錯；但是大多數(shù)研究者的經(jīng)驗式，電泳液可反復(fù)使用，內(nèi)槽一般選用新鮮電泳液，外槽可選用回收電泳液，外槽電泳液高度一般無特殊要求，有的研究者習(xí)慣外槽電泳液高度顯著低于內(nèi)槽電泳液高度，造成所謂“電勢差”，筆者經(jīng)驗這種電勢差對電泳時間和WB結(jié)果無明顯影響；此外，有研究者會疑惑電泳液可重復(fù)使用多少次，筆者經(jīng)驗是n次，n≥10，均不影響實驗結(jié)果。
5、轉(zhuǎn)膜：
小心撬開電泳凝膠板，裁取整塊分離膠并放入預(yù)冷的濕轉(zhuǎn)緩沖液，選取大小適當(dāng)?shù)腘C膜，按“三明治”的形式從上到下依次擺放2層海綿、2張濾紙、分離膠、NC膜（或PVDF膜）、2張濾紙、2層海綿，組裝濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)，灌滿預(yù)冷1× 濕轉(zhuǎn)緩沖液，沒過“三明治”，室溫100 V濕轉(zhuǎn)60 min；
tips：a、濕轉(zhuǎn)液需提前預(yù)冷，筆者習(xí)慣電泳開始時將濕轉(zhuǎn)液置入制冰器或者-20℃冰箱；b、轉(zhuǎn)模時最好整塊分離膠轉(zhuǎn)膜，以免裁膠時丟失部分蛋白；c、做“三明治”的基本原則是“黑膠白膜”，即分離膠貼近濕轉(zhuǎn)夾黑色面、NC膜貼近濕轉(zhuǎn)夾白色面（或紅色面）；d、在制備“三明治”時，筆者習(xí)慣膜在下方、膠在上方，如此蛋白條帶順序和SDS-PAGE正面時的上樣順序完全一致，方便記憶；e、濕轉(zhuǎn)液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，但也可重復(fù)使用，pubmed有團(tuán)隊證實濕轉(zhuǎn)液可重復(fù)使用5次，而不明顯影響實驗結(jié)果；f、濕轉(zhuǎn)時，最好在冰箱/冷室（cold room）或者置于冰盒中，在電泳時間小于1h時，筆者習(xí)慣預(yù)冷濕轉(zhuǎn)液、室溫轉(zhuǎn)膜；g、濕轉(zhuǎn)條件亦有選擇恒流的，比如200mA，2h等，筆者所使用的濕轉(zhuǎn)條件對分子量為15-140kd的蛋白均適用；h、PVDF膜需用甲醇預(yù)激（數(shù)秒鐘即可），使得PVDF帶正電，能更好地與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合，而NC膜無需預(yù)處理;i、制作“三明治”時注意排除SDS-PAGE膠與NC膜之間的氣泡。
6、封閉蛋白抗原
利用0.1% TBST配制10%脫脂牛奶，將NC膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出，并用0.1% TBST潤洗2-3次，每次5 min，加入適量脫脂牛奶，室溫?fù)u床上封閉60 min（封閉用牛奶、BSA或者封閉液均可回收，4℃保存，反復(fù)使用數(shù)次）；
7、抗原抗體反應(yīng)：
a. 0.1% TBST潤洗封閉后的NC膜3次，每次5 min；
b. 稀釋一抗：稀釋液通常為脫脂牛奶或0.1% TBST，比例通常為1：1000（稀釋比例參見抗體說明書）；
c. 孵育一抗：4 ℃下?lián)u床，過夜封閉；
d. 回收一抗，-20℃保存供重復(fù)使用，0.1% TBST潤洗NC膜3次，每次5 min；
e. 孵育二抗：0.1% TBST稀釋HRP標(biāo)記的對應(yīng)種屬的二抗，比例為1：5000-1：10000，室溫下?lián)u床孵育60 min；
f. 0.1% TBST潤洗NC膜3次，每次10 min；
tips：抗體孵育條件、時間等詳見《【W(wǎng)estern-Blotting】WB核心理論：抗原抗體特異性反應(yīng)》；
8、顯色
按1：1的比例將ECL發(fā)光劑中A液和B液混勻，轉(zhuǎn)有蛋白面的NC膜貼敷ECL發(fā)光液，室溫下反應(yīng)2 min，吸干ECL發(fā)光液，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影及膠片掃描（國內(nèi)較常用的是化學(xué)發(fā)光儀，但敏感性不如膠片曝光）。
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