生物制品的核酸殘留常用去除方法
隨著越來越多的生物制品進入治療領域，該類制品的質(zhì)量控制也日趨嚴格，其中核酸殘留一項是各類質(zhì)控標準的重中之重，因為DNA的穩(wěn)定性，容易在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生殘留，而這些生物制品應用到人類疾病治療時，會帶來不可控危險因素。終產(chǎn)品的宿主核酸殘留量必須遵循WHO、FDA和EMEA以及我國NMPA監(jiān)管條例。尤其近年來包括大牌進口產(chǎn)品在內(nèi)的狂犬疫苗DNA殘留超標問題，引起了社會和業(yè)界的廣泛關注。
生產(chǎn)生物制品的宿主細胞多是連續(xù)傳代細胞(continuouscelllines, CCLs)，其調(diào)控生長的基因失靈，而擁有無限增殖的能力，CCLs的殘留DNA可能使人體細胞生長失控，變成腫瘤細胞。所以需要嚴格控制生物制品的殘余DNA，避免這種風險危害。1984年的國際會議上采納了殘余DNA的臨時標準，即來自CCLs的生物制品DNA殘留不能超過10pg/人份劑量。1986年WHO的會議指出殘余宿主DNA的主要風險與其潛在致瘤活性有關。
此外，殘余DNA中可能存在感染性病毒基因組，病毒基因組能夠擴增并產(chǎn)生感染性病毒粒子。體外實驗表明，1pg逆轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒DNA就具有感染性。有些殘留DNA可能攜帶HIV病毒或者Ras致癌基因，DNA感染性風險可能比致瘤風險更高。
另外，有學者認為，接種幾十針疫苗后，其殘余的DNA累積可能具有其他潛在危害：未發(fā)生降解的外源DNA，在哺乳細胞基因LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作用下有插入細胞基因組的可能性，帶來其他潛在風險。
而且，由于微生物來源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內(nèi)的免疫原性風險，可能增加體內(nèi)免疫反應，誘導產(chǎn)生DNA抗體。
因此從安全角度，在生物制品的生產(chǎn)工藝中必須有去除DNA的步驟，并進行檢驗驗證。有研究采用病毒DNA定量感染的方法評價DNA的滅活程度，采用逐典全能核酸酶可消除其感染活性。WHO和各國藥物監(jiān)管機構一般控制100pg/每劑量的殘留DNA，特殊情況下最高允許10ng/劑量。
我國部分疫苗及治療用生物制品殘留DNA標準（中國藥典2015）
| 來源 | 名稱 | 細胞 | DNA殘留標準 |
| 進口疫苗 | 小兒麻痹疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 |
| 狂犬病疫苗 | Vero | 10ng odose-1 | |
| 國產(chǎn)疫苗 | 腎綜合征出血熱疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 |
| 乙型腦炎疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 | |
| 狂犬病疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 | |
| 乙型肝炎疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 | |
| 甲型肝炎滅活疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 | |
| 治療性生物制品 | EPO、單克隆抗體等 | CHO | 100pg 劑量-1 |
| 干擾素、GM-CSF、白介素等 | E.coli/Yeast | 10pg 劑量-1 |
我國參照WHO、FDA和歐盟標準，很早就對生物制品中殘余DNA含量進行限制。從衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點》到近年的《中國生物制品規(guī)程》和藥典，都對DNA殘留做了嚴格要求，部分標準高于國際標準。美國藥典2015版（USP38-NF33）中增加了新的章節(jié)（General Chapter<30>）來進一步規(guī)范殘留DNA的檢測方法和標準物質(zhì)。新版USP中將唯一推薦qPCR法作為生物制品中的宿主殘留DNA檢測方法。
此外，在CAR-T細胞治療中，病毒包裝后的核酸去除也是必要質(zhì)量控制，必須保證回輸?shù)募毎銐蚣�，減低風險和危害。
除卻生物制品中必須要去除核酸殘留，在平常的蛋白提取、生化分析樣品回收中，核酸殘留的影響也是非常大的，有效去除核酸殘留，可明顯降低細胞裂解液粘度，提高蛋白得率，蛋白生化分析中也可提高分辨率，并提高回收率。
在核酸殘留去除工作中，難點是由于DNA帶有大量的電荷易與其他生物大分子結合從而產(chǎn)生聚集（吸附）、包裹作用而難以完全除去。傳統(tǒng)的方法均存在低含量核酸殘留去除不凈、工作量大耗時長的致命缺陷，全能核酸酶可完美解決此類難點。
常用核酸去除方法
| 方法 | 作用 | 特點 |
| 離子交換層析 | DNA帶有大量的負電荷，可以被陰離子交換劑吸附而除去 | 負載量大、成本低廉，其缺點是在DNA殘留要求較高的情況下難以達到。 |
| 魚精蛋白沉淀 | 魚精蛋白為堿性蛋白，帶有大量的正電荷，能夠與DNA結合生產(chǎn)沉淀，從而將DNA去除 | 操作簡便、迅速，能有效降低DNA 殘留量。 其缺點在DNA殘留要求較高的情況下難以達到；需要使用大量的魚精蛋白，容易造成魚精蛋白殘留。 |
| DNaseI | DNase Ⅰ具有DNA酶活性而不具有RNA酶活性，主要用于RNA去除DNA | 用于重組蛋白等去除DNA活性偏低，效果不理想 |
| 全能核酸酶 | 能夠降解各種形式DNA和RNA，對單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯鍵均具有很高的活性，產(chǎn)生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸 | 高效去除核酸殘留，且對核酸沒有序列要求操作簡便耗時短 |
參考文獻
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