ELISA實(shí)驗(yàn)中TMB顯色底物詳解
HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。
DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。
5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。
OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。
目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。
另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。
3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的酶免試驗(yàn)顯色劑，能溶解于多種有機(jī)溶劑 和雙蒸水中，為穩(wěn)定的無色溶液，與適量過氧化脲或雙氧水與緩沖液混勻后與過氧化物酶作用產(chǎn)生清晰的藍(lán)色產(chǎn)物，極易觀察。由于其靈敏度高，配制后的工作液穩(wěn)定，加上無致癌特性，被廣泛用于酶聯(lián)免疫(ELISA)試驗(yàn)和尿試紙的檢測反應(yīng)等，TMB 主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，經(jīng)典的方法是采用A、B 液分開配制，使用前再混合的方法，并且長期存放穩(wěn)定，本試劑一般情況下為無色，有時(shí)略顯淺藍(lán)色或淺黃色。
TMB 底物顯色試劑盒(ELISA,HRP 顯色)主要由TMB 顯色液、TMB buffer、 TMB 氧化劑組成，其特點(diǎn)是：
1、靈敏度高；
2、穩(wěn)定性好，顯色終止后讀數(shù)穩(wěn)定；
3、背景低：底物溶液在 450nm 檢測時(shí)OD 值一般小于 0.05。該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考)：
1、用適當(dāng)?shù)母蓛羧萜?用純凈水反復(fù)沖洗)，取試劑(A)、(B)、(C)，按A：B：C= 5000：5000：4 的比例混合，即為TMB 顯色工作液，待達(dá)到室溫后即可使用。
2、加液：加完HRP 結(jié)合物并溫育一定時(shí)間，洗板 3～5 次，每孔加TMB 顯色工作液 100μl，在室溫(15～25℃)或 37℃下溫育 10～30 分鐘。
3、(選做)終止：加等體積的 1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)，孔中反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
4、讀數(shù)：30min 內(nèi)在 450nm 處讀數(shù)。
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。
DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。
5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。
OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。
目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。
另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。
3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是非常優(yōu)越的酶免試驗(yàn)顯色劑，能溶解于多種有機(jī)溶劑 和雙蒸水中，為穩(wěn)定的無色溶液，與適量過氧化脲或雙氧水與緩沖液混勻后與過氧化物酶作用產(chǎn)生清晰的藍(lán)色產(chǎn)物，極易觀察。由于其靈敏度高，配制后的工作液穩(wěn)定，加上無致癌特性，被廣泛用于酶聯(lián)免疫(ELISA)試驗(yàn)和尿試紙的檢測反應(yīng)等，TMB 主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，經(jīng)典的方法是采用A、B 液分開配制，使用前再混合的方法，并且長期存放穩(wěn)定，本試劑一般情況下為無色，有時(shí)略顯淺藍(lán)色或淺黃色。
TMB 底物顯色試劑盒(ELISA,HRP 顯色)主要由TMB 顯色液、TMB buffer、 TMB 氧化劑組成，其特點(diǎn)是：
1、靈敏度高；
2、穩(wěn)定性好，顯色終止后讀數(shù)穩(wěn)定；
3、背景低：底物溶液在 450nm 檢測時(shí)OD 值一般小于 0.05。該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考)：
1、用適當(dāng)?shù)母蓛羧萜?用純凈水反復(fù)沖洗)，取試劑(A)、(B)、(C)，按A：B：C= 5000：5000：4 的比例混合，即為TMB 顯色工作液，待達(dá)到室溫后即可使用。
2、加液：加完HRP 結(jié)合物并溫育一定時(shí)間，洗板 3～5 次，每孔加TMB 顯色工作液 100μl，在室溫(15～25℃)或 37℃下溫育 10～30 分鐘。
3、(選做)終止：加等體積的 1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)，孔中反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
4、讀數(shù)：30min 內(nèi)在 450nm 處讀數(shù)。
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