ELISA實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
ELISA是蛋白定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是免疫學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一。ELISA中出現(xiàn)的各種常見(jiàn)問(wèn)題，現(xiàn)分析一下：
一、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時(shí)，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時(shí)，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
二、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專(zhuān)用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體、酶等。對(duì)于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
三、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
遇到這種情況，很多人覺(jué)得是試劑盒問(wèn)題，這其實(shí)是一個(gè)誤區(qū)。任何一種實(shí)驗(yàn)方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無(wú)法檢測(cè)到。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測(cè)靈敏度。如采用信號(hào)增強(qiáng)劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測(cè)的ELISA、結(jié)合PCR擴(kuò)增的免疫PCR等等。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測(cè)率，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低的S7點(diǎn)，雖然可以計(jì)算得到數(shù)值，但實(shí)際上這個(gè)數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國(guó)內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒(méi)有采用信號(hào)增強(qiáng)劑的方法，而只是簡(jiǎn)單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。
四、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大。實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。大家可以參考關(guān)于移液器使用的文章，正確使用和維護(hù)移液器。個(gè)人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動(dòng)作，或者在幾十個(gè)離心管中加入相同體積的水，通過(guò)電子天平稱(chēng)量，檢驗(yàn)移液的精密度。同時(shí)還需練習(xí)加快加樣速度，減少?gòu)牡谝粋�(gè)樣本到最后一個(gè)樣本加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的差異。
五、本底偏高，樣本值測(cè)不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對(duì)于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過(guò)高會(huì)掩蓋目的信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀(guān)察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。
六、樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)?jì)算得到的樣本值差異較大
有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋?zhuān)敲次覀兙蜁?huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過(guò)稀釋后，干擾因素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值接近時(shí)，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的干擾因素影響較小，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對(duì)目的蛋白濃度較高的樣本而言。對(duì)于濃度很低的樣本，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就更加測(cè)不到了，此時(shí)可按照廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方式操作。
七、同一樣本使用不同廠(chǎng)家的ELISA試劑盒檢測(cè)，計(jì)算得到的樣本值差異較大
這里涉及到另一個(gè)評(píng)估試劑盒性能的參數(shù)——校準(zhǔn)。不同廠(chǎng)家采用的標(biāo)準(zhǔn)品可能有所不同，對(duì)其定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不同，這就是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此哪怕是同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，在不同廠(chǎng)家各自的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，結(jié)果可能也會(huì)差異很大。
因此，我們并不建議將不同廠(chǎng)家的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，除非他們都是用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了校準(zhǔn)。然而，并非所有蛋白都有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，因此使用不同廠(chǎng)家的產(chǎn)品計(jì)算的樣本值差異較大的現(xiàn)象也在所難免。
但都用同一廠(chǎng)家的試劑盒檢測(cè)樣本，那么結(jié)果還是可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的。
八、不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
一、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色
溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時(shí)，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時(shí)，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。
二、標(biāo)曲和樣本均不顯色
在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專(zhuān)用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測(cè)抗體、酶等。對(duì)于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。
三、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色
遇到這種情況，很多人覺(jué)得是試劑盒問(wèn)題，這其實(shí)是一個(gè)誤區(qū)。任何一種實(shí)驗(yàn)方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無(wú)法檢測(cè)到。目前ELISA仍然是蛋白檢測(cè)靈敏度最高的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測(cè)靈敏度。如采用信號(hào)增強(qiáng)劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測(cè)的ELISA、結(jié)合PCR擴(kuò)增的免疫PCR等等。
對(duì)于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測(cè)到樣本濃度，只能說(shuō)可以提高樣本的可測(cè)率，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度最低的S7點(diǎn)，雖然可以計(jì)算得到數(shù)值，但實(shí)際上這個(gè)數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國(guó)內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒(méi)有采用信號(hào)增強(qiáng)劑的方法，而只是簡(jiǎn)單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。
四、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大
這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會(huì)造成移液的誤差較大。實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。大家可以參考關(guān)于移液器使用的文章，正確使用和維護(hù)移液器。個(gè)人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動(dòng)作，或者在幾十個(gè)離心管中加入相同體積的水，通過(guò)電子天平稱(chēng)量，檢驗(yàn)移液的精密度。同時(shí)還需練習(xí)加快加樣速度，減少?gòu)牡谝粋�(gè)樣本到最后一個(gè)樣本加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的差異。
五、本底偏高，樣本值測(cè)不到
標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對(duì)于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過(guò)高會(huì)掩蓋目的信號(hào)，導(dǎo)致無(wú)法測(cè)到樣本值。
在加入TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀(guān)察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。
六、樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)?jì)算得到的樣本值差異較大
有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋?zhuān)敲次覀兙蜁?huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢？
這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過(guò)稀釋后，干擾因素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值接近時(shí)，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的干擾因素影響較小，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對(duì)目的蛋白濃度較高的樣本而言。對(duì)于濃度很低的樣本，經(jīng)過(guò)多倍稀釋后，就更加測(cè)不到了，此時(shí)可按照廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)推薦的加樣方式操作。
七、同一樣本使用不同廠(chǎng)家的ELISA試劑盒檢測(cè)，計(jì)算得到的樣本值差異較大
這里涉及到另一個(gè)評(píng)估試劑盒性能的參數(shù)——校準(zhǔn)。不同廠(chǎng)家采用的標(biāo)準(zhǔn)品可能有所不同，對(duì)其定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不同，這就是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此哪怕是同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，在不同廠(chǎng)家各自的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，結(jié)果可能也會(huì)差異很大。
因此，我們并不建議將不同廠(chǎng)家的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，除非他們都是用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了校準(zhǔn)。然而，并非所有蛋白都有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，因此使用不同廠(chǎng)家的產(chǎn)品計(jì)算的樣本值差異較大的現(xiàn)象也在所難免。
但都用同一廠(chǎng)家的試劑盒檢測(cè)樣本，那么結(jié)果還是可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的。
八、不同試劑盒中的組分能否通用
除非是公用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
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