免疫細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的介紹
免疫細(xì)胞（immune cells）是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，其在免疫細(xì)胞療法中扮演著至關(guān)重要的角色。
髓系免疫細(xì)胞（Myeloid immune cells）起源于骨髓，并包括多種類型的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等。這些細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有重要的功能，包括吞噬病原體、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和抗原呈遞等。
淋巴細(xì)胞（Lymphoid immune cells）起源于骨髓，并在淋巴組織（如脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體）中發(fā)揮重要的免疫功能。它們包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等。
外周血來源的PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群的一個(gè)常見方法。具體為外周血采集后，裝入含有適宜抗凝劑的無菌容器中防止凝集，其中要求外周血與抗凝劑輕柔混勻。目前，常用的抗凝劑有肝素、EDTA和枸櫞酸鈉等。適合于后期免疫細(xì)胞培養(yǎng)的抗凝劑常用是肝素。
2.2樣本制備
②取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；
③900g，離心30min，升1降1。
④離心完成后，依次從上而下，分別收集血漿（微黃色層）、單個(gè)核細(xì)胞（白膜層）。
⑤單個(gè)核細(xì)胞（白膜層）加入1-2倍的PBS，400g，離心10min后去掉上清，再加入1640培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗。
2.3細(xì)胞培養(yǎng)
加入完全培養(yǎng)液1ml重懸細(xì)胞，混勻計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度為3-10x105細(xì)胞/ml進(jìn)行鋪板培養(yǎng)。詳細(xì)完全培養(yǎng)添加主要組分如下：
（1）CD8+細(xì)胞培養(yǎng)從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中用IL-2、CD3/CD28激活劑體外激活和擴(kuò)增CD8+細(xì)胞。
IL-2對(duì)CD8/CTL的擴(kuò)增、存活和功能至關(guān)重要【1-2】。
離體產(chǎn)生記憶干T細(xì)胞的方法依賴于CD3 / CD28共刺激以及使用諸如IL-7和IL-15之類的細(xì)胞因子【3】。
（2）NK細(xì)胞培養(yǎng)
從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中用IL-2、IL-15、 IL-12 、IL-18等體外激活和擴(kuò)增NK細(xì)胞【4】。
NK細(xì)胞的殺傷活性，需要在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些刺激劑，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)提高細(xì)胞的殺傷活性。促進(jìn)NK細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。在一些研究中，還會(huì)添加一些其他的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等，以提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和殺傷作用。
（3）DC細(xì)胞培養(yǎng)
從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中用GM-CSF、IL-4和TNF-α體外誘導(dǎo)擴(kuò)增DC細(xì)胞。
GM-CSF，IL-4和TNF-α培養(yǎng)系統(tǒng)中人單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞（單DC）的粘附和非粘附細(xì)胞的純度，表型，抗原攝取能力和T淋巴細(xì)胞刺激能力。結(jié)果表明，粘附DC的純度和抗原攝取能力均顯著高于非粘附DC【5】。
（4）巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中用GM-CSF、M-CSF體外誘導(dǎo)擴(kuò)增巨噬細(xì)胞。
M1和M2巨噬細(xì)胞可以被人重組GM-CSF和M-CSF誘導(dǎo)【6】。
3.應(yīng)用
免疫細(xì)胞不僅可以消滅癌細(xì)胞，還可消滅傳染病和自身免疫疾病【7】。
4.參考文獻(xiàn)
【1】Kalia V, Sarkar S. Regulation of Effector and Memory CD8 T Cell Differentiation by IL-2-A Balancing Act. Front Immunol. 2018 Dec 20;9:2987. doi: 10.3389/fimmu.2018.02987. PMID: 30619342; PMCID: PMC6306427.
【2】Noto A, Ngauv P, Trautmann L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. 2013 Dec 17;(82):e51105. doi: 10.3791/51105. PMID: 24378436; PMCID: PMC4111270.
【3】Alvarez-Fernández C, Escribà-Garcia L, Vidal S, Sierra J, Briones J. A short CD3/CD28 costimulation combined with IL-21 enhance the generation of human memory stem T cells for adoptive immunotherapy. J Transl Med. 2016 Jul 19;14(1):214. doi: 10.1186/s12967-016-0973-y. PMID: 27435312; PMCID: PMC4952071.
【4】Lauwerys BR, Garot N, Renauld JC, Houssiau FA. Cytokine production and killer activity of NK/T-NK cells derived with IL-2, IL-15, or the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2000 Aug 15;165(4):1847-53. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847. PMID: 10925263.
【5】Yi HJ, Lu GX. Adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in GM-CSF, IL-4 and TNF-α culture system. Cell Immunol. 2012 May-Jun;277(1-2):44-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2012.05.014. Epub 2012 Jun 7. PMID: 22763269.
【6】Yamane K, Leung KP. Rabbit M1 and M2 macrophages can be induced by human recombinant GM-CSF and M-CSF. FEBS Open Bio. 2016 Aug 15;6(9):945-53. doi: 10.1002/2211-5463.12101. PMID: 27642558; PMCID: PMC5011493.
【7】Weber EW, Maus MV, Mackall CL. The Emerging Landscape of Immune Cell Therapies. Cell. 2020 Apr 2;181(1):46-62. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.001. PMID: 32243795; PMCID: PMC8900215.
- 簡介
髓系免疫細(xì)胞（Myeloid immune cells）起源于骨髓，并包括多種類型的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等。這些細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有重要的功能，包括吞噬病原體、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和抗原呈遞等。
淋巴細(xì)胞（Lymphoid immune cells）起源于骨髓，并在淋巴組織（如脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體）中發(fā)揮重要的免疫功能。它們包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等。
- 培養(yǎng)方法
外周血來源的PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群的一個(gè)常見方法。具體為外周血采集后，裝入含有適宜抗凝劑的無菌容器中防止凝集，其中要求外周血與抗凝劑輕柔混勻。目前，常用的抗凝劑有肝素、EDTA和枸櫞酸鈉等。適合于后期免疫細(xì)胞培養(yǎng)的抗凝劑常用是肝素。
2.2樣本制備
- 單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的獲�。褐苽浞椒槌Ｓ肍icoll密度梯度離心法。具體方法如下：
②取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；
③900g，離心30min，升1降1。
④離心完成后，依次從上而下，分別收集血漿（微黃色層）、單個(gè)核細(xì)胞（白膜層）。
⑤單個(gè)核細(xì)胞（白膜層）加入1-2倍的PBS，400g，離心10min后去掉上清，再加入1640培養(yǎng)基進(jìn)行相同操作的清洗。
2.3細(xì)胞培養(yǎng)
加入完全培養(yǎng)液1ml重懸細(xì)胞，混勻計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度為3-10x105細(xì)胞/ml進(jìn)行鋪板培養(yǎng)。詳細(xì)完全培養(yǎng)添加主要組分如下：
（1）CD8+細(xì)胞培養(yǎng)從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中用IL-2、CD3/CD28激活劑體外激活和擴(kuò)增CD8+細(xì)胞。
IL-2對(duì)CD8/CTL的擴(kuò)增、存活和功能至關(guān)重要【1-2】。
離體產(chǎn)生記憶干T細(xì)胞的方法依賴于CD3 / CD28共刺激以及使用諸如IL-7和IL-15之類的細(xì)胞因子【3】。
（2）NK細(xì)胞培養(yǎng)
NK細(xì)胞的殺傷活性，需要在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加一些刺激劑，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)提高細(xì)胞的殺傷活性。促進(jìn)NK細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。在一些研究中，還會(huì)添加一些其他的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等，以提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和殺傷作用。
（3）DC細(xì)胞培養(yǎng)
GM-CSF，IL-4和TNF-α培養(yǎng)系統(tǒng)中人單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞（單DC）的粘附和非粘附細(xì)胞的純度，表型，抗原攝取能力和T淋巴細(xì)胞刺激能力。結(jié)果表明，粘附DC的純度和抗原攝取能力均顯著高于非粘附DC【5】。
（4）巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
M1和M2巨噬細(xì)胞可以被人重組GM-CSF和M-CSF誘導(dǎo)【6】。
3.應(yīng)用
4.參考文獻(xiàn)
【2】Noto A, Ngauv P, Trautmann L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. 2013 Dec 17;(82):e51105. doi: 10.3791/51105. PMID: 24378436; PMCID: PMC4111270.
【3】Alvarez-Fernández C, Escribà-Garcia L, Vidal S, Sierra J, Briones J. A short CD3/CD28 costimulation combined with IL-21 enhance the generation of human memory stem T cells for adoptive immunotherapy. J Transl Med. 2016 Jul 19;14(1):214. doi: 10.1186/s12967-016-0973-y. PMID: 27435312; PMCID: PMC4952071.
【4】Lauwerys BR, Garot N, Renauld JC, Houssiau FA. Cytokine production and killer activity of NK/T-NK cells derived with IL-2, IL-15, or the combination of IL-12 and IL-18. J Immunol. 2000 Aug 15;165(4):1847-53. doi: 10.4049/jimmunol.165.4.1847. PMID: 10925263.
【5】Yi HJ, Lu GX. Adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in GM-CSF, IL-4 and TNF-α culture system. Cell Immunol. 2012 May-Jun;277(1-2):44-8. doi: 10.1016/j.cellimm.2012.05.014. Epub 2012 Jun 7. PMID: 22763269.
【6】Yamane K, Leung KP. Rabbit M1 and M2 macrophages can be induced by human recombinant GM-CSF and M-CSF. FEBS Open Bio. 2016 Aug 15;6(9):945-53. doi: 10.1002/2211-5463.12101. PMID: 27642558; PMCID: PMC5011493.
【7】Weber EW, Maus MV, Mackall CL. The Emerging Landscape of Immune Cell Therapies. Cell. 2020 Apr 2;181(1):46-62. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.001. PMID: 32243795; PMCID: PMC8900215.
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