實驗目的：
本實驗方案利用微滴/微球制備儀，以含有螯合物Ca-EDTA和海藻酸鈉的溶液為水相1，以含有螯合物Zn-EDDA和海藻酸鈉的溶液為水相2，以Drop-Surf微滴生成油為油相制備高單分散的海藻酸鈉凝膠微球(CV<5%)。
 
引言：
水凝膠是一類重要的軟性材料，被廣泛應用于藥物研究、藥物遞送、組織工程和食品科學等領域。在眾多制備水凝膠的天然高分材料中，海藻酸鹽作為一種天然多糖，由于其低毒性、溫和的離子交聯(lián)條件、良好的生物相容性和生物可降解性等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領域得到極大的關注^[1]。
目前，現(xiàn)有技術報道了微米大小的海藻酸鹽凝膠珠作為3D細胞培養(yǎng)的生物支架模擬細胞生長的基質環(huán)境，被廣泛應用于活細胞的封裝、培養(yǎng)和監(jiān)測^[2]。Uyen N.T.T.等人發(fā)現(xiàn)微米級的海藻酸鹽凝膠微球既可以控制藥物的釋放速度，又能將藥物遞送到特定的治療靶點，且藥物釋放后的海藻酸鹽可直接被降解通過代謝排出體內(nèi)^[3]。通常情況下，海藻酸鹽水溶液在封裝過程中與Ca²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺和Sr²⁺等二價陽離子進行離子交聯(lián)以制備海藻酸鹽凝膠。如將海藻酸鈉滴入過量的氯化鈣水溶液中，并通過攪拌或超聲制備海藻酸鹽微凝膠珠^[4]。然而，這種方法生產(chǎn)的微凝膠存在粒徑單分散性差和形狀不規(guī)則等缺點。因此，生產(chǎn)單分散性良好和結構均勻的凝膠珠仍存在不少問題。
采用液滴微流控技術可以生產(chǎn)形狀精確可控和粒徑均一的海藻酸鹽凝膠。通常，海藻酸鈉溶液在液滴微流控芯片中乳化并分散在油相中，并與Ca²⁺進行交聯(lián)。而這種快速的交聯(lián)反應可能導致液滴生成粒徑不均和微流控芯片的堵塞。因此，采用液滴微流控制備時需將液滴生成與凝膠化反應分開。現(xiàn)有技術中公開了通過將CaCO₃納米顆粒分散于海藻酸鹽水溶液中，然后將生成后的液滴暴露在酸性條件下，導致CaCO₃的溶解釋放Ca²⁺，并使其與海藻酸鹽交聯(lián)凝膠化^[5]。然而，由于CaCO₃呈顆粒狀，pH降低導致Ca²⁺的釋放分布不均，進而使得離子交聯(lián)均勻性較差。此外，納米顆粒的團聚也會導致微流控芯片流道的堵塞。
為此，Utech等通過用螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)螯合Ca²⁺形成Ca-EDTA，使其穩(wěn)定的分散在海藻酸鹽溶液中。然后，將經(jīng)微流控芯片制備微液滴的油水混合物通入酸性的油相中，Ca²⁺由H⁺與EDTA的結合而被釋放，并與海藻酸鹽交聯(lián)形成凝膠珠^[6]。雖然這種方法可以制備結構均勻的離子交聯(lián)海藻酸鹽凝膠珠，但該工藝凝膠固化所需的pH(pH<5)較低。這很有可能會嚴重影響細胞的存活，不利于細胞和組織生長。
基于以上存在的問題，FluidicLab微滴制備平臺通過借助配體與離子結合能力的不同，實現(xiàn)凝膠離子Ca²⁺有序可控的釋放，以達到海藻酸鈉微球凝膠固化的目的^[7,8]。其原理示意圖下圖所示，將含有螯合物Ca-EDTA和海藻酸鈉的溶液作為水相1，含有螯合物Zn-EDDA和海藻酸鈉的溶液作為水相2；當兩種水相混合后，因螯合劑與金屬離子的結合能力存在差異，Zn²⁺會與EDTA結合從而導致Ca²⁺的釋放，而被釋放的Ca²⁺與海藻酸鈉反應實現(xiàn)凝膠固化。通過上述方式結合FluidicLab微滴制備平臺制備的海藻酸鈉凝膠微球是在中性、低離子濃度的溫和條件下進行的，制備反微球粒徑均一性高，反應速度快，凝膠固化時間短，大大減少對健康細胞的傷害。  
實驗材料：

試劑	微滴生成油(Drop-Surf，FluidicLab)
	破乳劑(Drop-Surf，F(xiàn)luidicLab)
	海藻酸鈉(FluidicLab)
	無水氯化鈣(Macklin, C805228-100 g)
	EDTA溶液(Macklin, 0.5 M, pH 7.4, E885215-1L)
	乙二胺-N, N′-二乙酸(EDDA, Macklin, E838453-5 G)
	無水醋酸鋅(Macklin, E820824-25 G)
	氫氧化鈉(Macklin, S817971-500 G)
	PBS緩沖液粉末(Macklin, P854529-10EA)
耗材	50 mL離心管(Falcon 50 mL REF 352098)若干
	15 mL離心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干
	1.5/2 mL離心管若干
	內(nèi)/外徑0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接頭
	0.22 μm針式過濾器(PTFE材質)和注射器若干
芯片夾具	PDMS-SCE-100/50/30 μm芯片(FluidicLab)
	PDMS標準芯片夾具
設備	Fluidiclab微滴/微球制備儀(三通道)
輔助設備	電腦(Win10 以上系統(tǒng))
	普通光學顯微鏡(用于測微球粒徑)
	梅特勒托利多pH計

 
實驗步驟：

1. 試劑配制：

① 2 M CaCl₂ 溶液配制：
取2.2197 g的無水CaCl₂ (M_CaCl2=110.984 g/moL)加入超純水振蕩溶解，最終定容至10 mL備用。
② 2 % (wt%)海藻酸鈉溶液配制：
取0.2 g的海藻酸鈉固體粉末加入超純水超聲振蕩，60 ℃加熱輔助溶解，最終定容至10 mL備用。
③ 2 M NaOH溶液配制
取1.6 g的NaOH(M_NaOH=176.17 g/moL)加入超純水振蕩溶解，最終定容至20 mL備用。
④ 80 mM Ca-EDTA溶液(pH=6.7)
取400 μL配制的2 M CaCl₂與1.6 mL 的0.5 M EDTA振蕩均勻，加入5 mL超純水振蕩均勻，然后滴加2M NaOH調(diào)整pH至6.7左右，最終加入超純水定容至10 mL。
【注】下表加入體積供參考，實際加入量以pH值變化為準。

序號	依次加入2 M NaOH體積(μL)	pH測量值
1	0	3.92
2	200	4.38
3	150	5.97
4	5	6.21
5	3	6.38
6	2	6.51
7	1	6.58
8	0.5	6.63
9	0.5	6.67
總體積	362	/

⑤ 80 mM Zn-EDDA溶液(pH=6.7)
取0.1465 g的無水Zn(CH₃CHO₂)₂ (M_Zn(CH3CHO2)2=183.48 g/moL)與0.1416 g的乙二胺-N, N′-二乙酸(EDDA，M_EDDA=176.17 g/moL)，加入5 mL超純水超聲振蕩溶解，然后滴加2M NaOH調(diào)整pH至6.7左右，最終加入超純水定容至10 mL。
【注】下表加入體積供參考，實際加入量以pH值變化為準。

序號	依次加入2 M NaOH體積(μL)	pH測量值
1	0	3.96
2	500	5.01
3	200	5.71
4	40	6.06
5	20	6.44
6	3	6.53
7	2	6.62
8	1	6.65
9	0.5	6.68
總體積	766.5	/

⑥ 水相1配制(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Ca-EDTA)
取等體積80 mM Ca-EDTA溶液與1.2%海藻酸鈉溶液振蕩均勻得到分散相1，用0.22 μm針式過濾器過濾備用。
⑦ 水相2配制(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Zn-EDDA)
取等體積80 mM Zn-EDDA溶液與1.2%海藻酸鈉溶液振蕩均勻得到分散相2，用0.22 μm針式過濾器過濾備用。
2. 海藻酸鈉微球制備：

1. 微滴/微球制備儀的安裝連接

微滴/微球制備儀安裝連接參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“2. 微滴/微球制備儀的安裝連接”的部分；其連接如下(步驟③-⑦連接效果如下圖所示)：
   
① 用氣管依次連接“空氣壓縮機”--“氣源處理裝置”--“微滴/微球制備儀”；
② 將微滴/微球制備儀分別與電源、電腦的連接；
③ 用氣管分別將A₀(壓力輸出通道一)和A₁(油相15 mL儲液池)，B₀(壓力輸出通道二)和B₁(水相1的2 mL儲液池)連接，C₀(壓力輸出通道三)和C₁(水相2的2 mL儲液池)；
④ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A₁(油相15 mL儲液池)和A₂(通道一流量傳感器)，B₁(水相1的2 mL儲液池)和B₂(通道二流量傳感器)連接，C₁(水相2的2 mL儲液池)和C₂(通道三流量傳感器)連接；
⑤ 用配有1/4-28螺紋接頭和卡箍的PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)分別將A₂(通道一流量傳感器)和A₃(PDMS芯片的油相入口)，B₂(通道二流量傳感器)和B₃(PDMS芯片的水相1入口)連接，C₂(通道三流量傳感器)和C₃(PDMS芯片的水相2入口)連接；
⑥ D為標準PDMS芯片和夾具的組合，芯片和夾具的入口通過硅膠塞密封；
⑦ 用PEEK管(內(nèi)/外徑 0.25 mm/1.6 mm)將芯片出口E處生成的乳液導出。
2. FluidicLabSuite軟件的安裝和設備的添加：
FluidicLabSuite軟件的安裝參考《微滴/微球制備儀使用手冊V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite軟件的安裝”的部分(相機和流量傳感器僅需添加一次)；
3. 海藻酸鈉微滴的制備和固化：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴制備儀制備海藻酸鈉微球”)：
① 分別在15 mL油相儲液池(通道一)，2 mL水相1儲液池(通道二)和2 mL水相2儲液池(通道三)中依次加入5 mL微滴生成油，2 mL 水相1(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Ca-EDTA)和2 mL水相2(0.6%海藻酸鈉, 40 mM Zn-EDDA)；
② 打開空氣壓縮機和氣源處理裝置開關；
③ 在乳液出口端放置離心管接收微滴穩(wěn)定前的廢液；
④ 在電腦端設置通道一壓力(油相，如250 mbar)、通道二壓力(水相1，如350 mbar)和通道三壓力(水相2，如350 mbar)排出管路和芯片中的空氣；
⑤ 待管路和芯片中填充滿液體后(空氣被完全排出)，將整個系統(tǒng)由壓力控制切換到流速控制，并設置通道一(油相)，通道二(水相1)和通道三(水相2)流速分別為20，5和5 μL/min；
⑥ 調(diào)整反饋值(Feedback)快速達到設定流速，并實現(xiàn)流速的穩(wěn)定輸出；
⑦ 用疏水培養(yǎng)皿接收一滴乳液，并在普通光學顯微鏡下觀察其微滴的均勻性；
⑧ 待微滴生成均勻后，即可開始接收1.5 mL離心管中；
⑨ 一段時間后停止收集，密封于離心管中，靜置10 min固化。
4. 海藻酸鈉微球的破乳清洗：
具體操作步驟如下(參考視頻“微流控應用：微滴制備儀制備海藻酸鈉微球”)：
① 取出1.5 mL離心管底部微滴生成油；
② 按V_球：V_破=1:2 加入破乳劑，振蕩破乳；
③ 1000 rpm離心處理30 s，并取出底部破乳劑；
④ 重復上述②和③操作；
⑤ 最終將得到海藻酸鈉微球分散于配制的PBS緩沖液中。
5. 微滴/微球制備儀清洗：
微滴生成儀每次使用完必須清洗管路、流量傳感器和芯片。具體操作詳見“微滴/微球制備儀操作指導卡”。
 
結果與討論：
剛接收的微滴平均粒徑為101.74 μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=1.30%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示： 微滴交聯(lián)固化分散于PBS中的海藻酸鈉微球平均粒徑為96.08 μm，具有極高的單分散性(變異系數(shù):CV=2.52%)。其顯微鏡圖和粒徑分布如下圖所示： 此外，我們也采用了不同類型的芯片制備了1%海藻酸鈉微球，其中水相1中Ca-EDTA和水相2中的Zn-EDDA濃度都為40 mM。具體參數(shù)如下表所示：

芯片類型	油相		水相1		水相2		微滴粒徑 (μm)	CV(%)	微球粒徑 (μm)	CV(%)
	流速 (μL/min)	壓力 (mbar)	流速 (μL/min)	壓力 (mbar)	流速 (μL/min)	壓力 (mbar)
PDMS-SCE-100	10	85	1.5	366	1.5	366	101.68	1.69	107.24	1.61
	10	114	4.5	855	4.5	859	112.39	1.99	110.54	2.03
	20	166	5	959	5	944	100.60	1.81	103.16	1.76
	20	176	6.5	1110	6.5	1081	106.57	1.72	107.24	1.71
PDMS-SCE-50	4	174	1	1145	1	1157	53.83	2.66	58.39	4.10
	4	251	2	1727	2	1658	60.07	2.49	65.94	3.37
	8	309	2	1700	2	1663	51.28	2.62	55.81	3.99
PDMS-SCE-30	5	/	2	/	2	/	33.72	2.81	34.42	3.46

參考文獻：
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[3] Uyen N.T.T.,et al. Fabrication of alginate microspheres for drug delivery: a review，Int. J. Biol. Macromol., 153, 1035-1046 (2020).
[4] Rajaonarivony M., et al. Development of a New Drug Carrier Made from Alginate，J.  Pharm. Sci-US, 82, 912-917 (1993).
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