A20，或腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TnFAIP3)，是一種鋅指泛素編輯抗炎酶，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。A20基因突變體和A20單倍體與幾種自身免疫性和自身炎癥性疾病有關(guān)1-4，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病關(guān)節(jié)炎5-7。利用動(dòng)物模型進(jìn)行的研究證實(shí)了A20在自身炎癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)病機(jī)制中的作用，并幫助確定了相關(guān)機(jī)制8-9。首先確定的是A20發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制是通過抑制NF-κB的活性10。據(jù)報(bào)道，A20 的酶功能還能保護(hù)自身炎癥，包括通過去泛素化受體相互作用蛋白激酶3(RIPK3)抑制壞死性下垂11 (圖1)。
 

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以炎癥性關(guān)節(jié)炎和多種全身癥狀為特征。在傳統(tǒng)的改變病情抗風(fēng)濕藥（DMARDs）中加入免疫抑制生物制劑，改善了對(duì) RA的治療12。然而，目前尚無根治方法，其發(fā)病機(jī)制仍未被完全闡明。近年來，A20蛋白中的兩個(gè)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZnF4和ZnF7，被證明是抑制炎癥依賴性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵9-13。本文將回顧揭示A20泛素結(jié)合在RA和相關(guān)關(guān)節(jié)炎疾病中的重要性的證據(jù)。

 

圖1. A20的域結(jié)構(gòu)。A20由一個(gè)N端卵巢腫瘤(OTU)結(jié)構(gòu)域和由七個(gè)鋅指(ZF1-ZF7) 構(gòu)建的 7C 端結(jié)構(gòu)域組成。

 

1.ZnF7和ZnF4泛素結(jié)合基團(tuán)介導(dǎo)A20的抗炎作用

雖然在動(dòng)物模型中，A20的丟失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥性疾病和過早死亡14，但在催化去泛素化酶(DUB)和E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域失活突變的小鼠則發(fā)育正常，并且不會(huì)影響NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)15-17。因此，在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中，除了 A20 的催化活性之外，顯然還有其他因素參與其中。
 

為了研究ZnF7泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域在A20中的生理作用，Martens 等人在 A20 的 ZnF7結(jié)構(gòu)域中做了兩個(gè)失活點(diǎn)突變，從而產(chǎn)生了突變小鼠18。這些小鼠比對(duì)照型小鼠小，并出現(xiàn)自發(fā)性炎癥病理變化，表現(xiàn)為脾臟腫大、關(guān)節(jié)炎癥、爪腫脹、多組織免疫細(xì)胞浸潤、血清細(xì)胞因子水平升高以及脾臟中髓系細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞數(shù)量增加。他們利用從這些小鼠體內(nèi)分離的胚胎成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步證明了ZnF7結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏20介導(dǎo)的抑制炎癥信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡至關(guān)重要。
 

然而，在ZnF7突變小鼠身上觀察到的表型并不像A20缺失小鼠那樣嚴(yán)重。在ZnF4泛素結(jié)合域增加了兩個(gè)失活點(diǎn)突變，小鼠的表型與完全缺失 A20 的小鼠相似，其后代嚴(yán)重畸形，無法存活過斷奶期，并出現(xiàn)嚴(yán)重的多器官炎癥和肝細(xì)胞凋亡。因此，ZnF7 和 ZnF4 這兩個(gè)泛素結(jié)合域的聯(lián)合失活對(duì)于炎癥性疾病的發(fā)生至關(guān)重要18。他們進(jìn)一步的研究揭示，ZnF7 結(jié)構(gòu)域是將 A20 募集到腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）復(fù)合物所必需的。重要的是，條件性組織特異性消減或表達(dá)突變型 A20 揭示了泛素結(jié)合在骨髓細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中促進(jìn)炎癥表型的關(guān)鍵作用。

 

2.A20非催化泛素結(jié)合能夠預(yù)防類銀屑病關(guān)節(jié)炎疾病

僅僅幾天后，Razani等人在同一本雜志Nature Immunology上發(fā)表了文章，證實(shí)了ZnF7 和 ZnF4 結(jié)構(gòu)域的重要性19。他們將ZnF7（A20ZNF7）或ZnF4（A20ZNF4）中攜帶半胱氨酸和丙氨酸點(diǎn)突變的小鼠與對(duì)照型小鼠和催化DUB結(jié)構(gòu)域突變的小鼠進(jìn)行了比較。至少在出生后的前四個(gè)月，ZnF4或催化結(jié)構(gòu)域突變的小鼠發(fā)育正常，而ZnF7突變的小鼠從6周大開始出現(xiàn)漸進(jìn)性指關(guān)節(jié)腫脹，到12周大時(shí)所有指關(guān)節(jié)都腫脹。此外，突變的ZnF7小鼠出現(xiàn)了遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎和自發(fā)性免疫激活，而其他基因型的小鼠則沒有這些表型。
 

通過將A20ZNF7小鼠與缺乏B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的Rag1-/-小鼠雜交，他們確定A20ZNF7驅(qū)動(dòng)的關(guān)節(jié)炎需要淋巴細(xì)胞，因?yàn)锳20ZNF7xRag1-/-發(fā)育正常。為了確定這一現(xiàn)象是否由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或兩者共同作用，他們進(jìn)一步將A20ZNF7小鼠與缺乏B細(xì)胞的μMT小鼠雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)展與免疫能力強(qiáng)的A20ZNF7小鼠相似，表明A20ZNF7驅(qū)動(dòng)的關(guān)節(jié)炎需要T細(xì)胞，而不是B細(xì)胞。Marten研究小組發(fā)現(xiàn)，在他們的模型中，骨髓細(xì)胞群中的 A20 對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要18。有趣的是，本研究證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，并證明髓系分化因子MyD88信號(hào)是A20ZNF7驅(qū)動(dòng)的關(guān)節(jié)炎發(fā)生所必需的19。他們的研究進(jìn)一步揭示，A20的ZnF7基序是防止IKK活性延長、NF-κB依賴基因表達(dá)和關(guān)節(jié)炎發(fā)展所必需的。
 

與前一篇論文一樣，他們隨后研究了突變體ZnF7和ZnF4的組合，因?yàn)閱为?dú)使用突變體ZnF7并不能再現(xiàn)完全缺失A20的嚴(yán)重程度。這一組合是協(xié)同作用的，突變ZnF7和ZnF4的小鼠會(huì)患上更嚴(yán)重的疾病。這兩篇論文在幾天內(nèi)相繼發(fā)表，鞏固了這兩個(gè)A20泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域在預(yù)防炎癥性關(guān)節(jié)炎方面的重要性。

 

3.A20 是治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)

正如在本文中所討論的，髓系細(xì)胞中A20泛素結(jié)合域的缺失或突變會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)類風(fēng)濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。2021年的一項(xiàng)研究顯示，與健康的人相比，RA患者循環(huán)單核細(xì)胞數(shù)量增加，而循環(huán)單核細(xì)胞中A20水平降低，這表明單核細(xì)胞中的A20可能對(duì)RA的發(fā)展起到保護(hù)作用20�？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，我國的研究人員報(bào)告了一項(xiàng)在小鼠身上進(jìn)行的概念驗(yàn)證性研究，以確定通過基因療法傳遞A20過表達(dá)這種保護(hù)性蛋白是否可以改善關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。事實(shí)上，他們觀察到，與接受對(duì)照載體rAAV6-CMV-EGFP的小鼠相比，接受rAAV6-CMV-A20的小鼠的臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分、爪部厚度和孔隙率、骨體積和其他RA相關(guān)指標(biāo)都有所改善21。了解A20蛋白影響疾病發(fā)病機(jī)制對(duì)于開發(fā)有效的RA治療方法至關(guān)重要，本文中討論的幾乎同時(shí)進(jìn)行的研究強(qiáng)調(diào)，A20的泛素結(jié)合功能而非其催化功能是防止關(guān)節(jié)炎發(fā)展的關(guān)鍵。

 

參考文獻(xiàn)：

1.Aeschlimann FA, Batu ED, Canna SW, Go E, Gul A, Hoffmann P, et al. A20 haploinsufficiency (HA20): clinical phenotypes and disease course of patients with a newly recognised NF-kB-mediated autoinflammatory disease. Ann Rheum Dis. 2018;77(5):728-35.

2.Duncan CJA, Dinnigan E, Theobald R, Grainger A, Skelton AJ, Hussain R, et al. Early-onset autoimmune disease due to a heterozygous loss-of-function mutation in TNFAIP3 (A20). Ann Rheum Dis. 2018;77(5):783-6.

3.Kadowaki T, Ohnishi H, Kawamoto N, Hori T, Nishimura K, Kobayashi C, et al. Haploinsufficiency of A20 causes autoinflammatory and autoimmune disorders. J Allergy Clin Immunol. 2018;141(4):1485-8 e11.

4.Zhou Q, Wang H, Schwartz DM, Stoffels M, Park YH, Zhang Y, et al. Loss-of-function mutations in TNFAIP3 leading to A20 haploinsufficiency cause an early-onset autoinflammatory disease. Nat Genet. 2016;48(1):67-73.

5.Chen Y, Ye Z, Chen L, Qin T, Seidler U, Tian D, et al. Association of Clinical Phenotypes in Haploinsufficiency A20 (HA20) With Disrupted Domains of A20. Front Immunol. 2020;11:574992.

6.Odqvist L, Jevnikar Z, Riise R, Oberg L, Rhedin M, Leonard D, et al. Genetic variations in A20 DUB domain provide a genetic link to citrullination and neutrophil extracellular traps in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 2019;78(10):1363-70.

7.Rajamaki K, Keskitalo S, Seppanen M, Kuismin O, Vahasalo P, Trotta L, et al. Haploinsufficiency of A20 impairs protein-protein interactome and leads into caspase-8-dependent enhancement of NLRP3 inflammasome activation. RMD Open. 2018;4(2):e000740.

8.Matmati M, Jacques P, Maelfait J, Verheugen E, Kool M, Sze M, et al. A20 (TNFAIP3) deficiency in myeloid cells triggers erosive polyarthritis resembling rheumatoid arthritis. Nat Genet. 2011;43(9):908-12.

9.Wu Y, He X, Huang N, Yu J, Shao B. A20: a master regulator of arthritis. Arthritis Res Ther. 2020;22(1):220.

10.Ma A, Malynn BA. A20: linking a complex regulator of ubiquitylation to immunity and human disease. Nat Rev Immunol. 2012;12(11):774-85.

11.Onizawa M, Oshima S, Schulze-Topphoff U, Oses-Prieto JA, Lu T, Tavares R, et al. The ubiquitin-modifying enzyme A20 restricts ubiquitination of the kinase RIPK3 and protects cells from necroptosis. Nat Immunol. 2015;16(6):618-27.

12.Shams S, Martinez JM, Dawson JRD, Flores J, Gabriel M, Garcia G, et al. The Therapeutic Landscape of Rheumatoid Arthritis: Current State and Future Directions. Front Pharmacol. 2021;12:680043.

13.Polykratis A, Martens A, Eren RO, Shirasaki Y, Yamagishi M, Yamaguchi Y, et al. A20 prevents inflammasome-dependent arthritis by inhibiting macrophage necroptosis through its ZnF7 ubiquitin-binding domain. Nat Cell Biol. 2019;21(6):731-42.

14.Lee EG, Boone DL, Chai S, Libby SL, Chien M, Lodolce JP, et al. Failure to regulate TNF-induced NF-kappaB and cell death responses in A20-deficient mice. Science. 2000;289(5488):2350-4.

15.Wertz IE, Newton K, Seshasayee D, Kusam S, Lam C, Zhang J, et al. Phosphorylation and linear ubiquitin direct A20 inhibition of inflammation. Nature. 2015;528(7582):370-5.

16.De A, Dainichi T, Rathinam CV, Ghosh S. The deubiquitinase activity of A20 is dispensable for NF-kappaB signaling. EMBO Rep. 2014;15(7):775-83.

17.Lu TT, Onizawa M, Hammer GE, Turer EE, Yin Q, Damko E, et al. Dimerization and ubiquitin mediated recruitment of A20, a complex deubiquitinating enzyme. Immunity. 2013;38(5):896-905.

18.Martens A, Priem D, Hoste E, Vetters J, Rennen S, Catrysse L, et al. Two distinct ubiquitin-binding motifs in A20 mediate its anti-inflammatory and cell-protective activities. Nat Immunol. 2020;21(4):381-7.

19.Razani B, Whang MI, Kim FS, Nakamura MC, Sun X, Advincula R, et al. Non-catalytic ubiquitin binding by A20 prevents psoriatic arthritis-like disease and inflammation. Nat Immunol. 2020;21(4):422-33.

20.Zhang L, Yao Y, Tian J, Jiang W, Zhou S, Chen J, et al. Alterations and abnormal expression of A20 in peripheral monocyte subtypes in patients with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2021;40(1):341-8.

21.Zhang Q, Yu FX, Wu YL, Yang CY, Liu NC, Zhu X, et al. Novel gene therapy for rheumatoid arthritis with single local injection: adeno-associated virus-mediated delivery of A20/TNFAIP3. Mil Med Res. 2022;9(1):34.